核内miR-199b-5p通过上调CDK9表达促进心肌细胞肥大*

易芷瑶， 赵安职， 张 铭， 曾 妮， 朱杰宁， 杨 莹，严钰敏， 郭惠明， 单志新，，，△

（1华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006；2南方医科大学药学院，广东广州510515；3广东省临床药理学重点实验室，广东省人民医院，广东省医学科学院，广东广州510080；4华南理工大学医学院，广东广州510006）

生理性和病理性心肌肥大时，心肌细胞体积增大，从而在不改变心肌细胞数量的情况下，提高心肌功能输出，维持心脏功能［1］。心力衰竭（heart failure，HF）最初是因为心肌损伤引起心肌结构和功能的变化，进而导致心室泵血不足和（或）充盈功能低下。现在已基本明确，导致心力衰竭发生发展的基本机制是心肌重构（cardiac remodeling），阻断心肌重构是治疗心衰的关键，而心肌肥大是心肌重构过程中非常重要的方面，心力衰竭往往由心肌肥大演变而来［2］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类长度约为20～22 个核苷酸的内源性非编码RNA，它在动植物及病毒中广泛分布，不仅对人体内的细胞发育及分化、细胞周期和稳态等进行调节，还影响着生物体内各种病理状态的进程，参与多种疾病的发病机制［3-4］。miRNA 参与调控心肌重构过程，有研究证实miR-21 通过激活ERK 信号通路从而促进纤维化的进展以及房颤的易感性［5］。我们发现miR-199a-3p通过靶向视网膜母细胞瘤转录辅阻遏子1 促进心肌细胞肥大［6］；miR-199a-5p［7］和miR-23b-3p［8］分别通过靶向沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）和转化生长因子β 受体3（transforming growth factor β receptor 3，TGFBR3）发挥促进心肌纤维化相关基因表达的作用；miR-34a-5p［9］可通过靶向抑制SIRT1表达发挥促阿霉素诱导心肌细胞凋亡的作用。

近年来的研究发现，miRNA 亦可存在于细胞核中，且胞核内的miRNA 在调控基因表达中发挥重要作用［10］，从而打破了经典的在胞质中miRNA 通过RNA 诱导的沉默复合物（RAN-induced silencing com⁃plex，RISC）发挥转录后基因沉默作用的认识［4］，给研究miRNA 参与广泛的基因调控作用以及多种疾病的治疗提供了新的思路。

miR-199b-5p 是miR-199 家族的一员［11］，miR-199 家族已被证明参与病理性心肌肥大过程［12］。我们前期的实验数据显示，心衰患者心肌组织中的miR-199b-5p 水平显著提高，但其在心肌细胞中的分布及对心肌肥大的调控作用尚未被阐明。本研究将初步探讨心肌细胞核内miR-199b-5p 对心肌肥大相关基因表达的调控作用及可能机制。

材料和方法

1 动物

出生1～3 d的SPF级C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（粤）2013-0034。

2 细胞株和主要试剂

人心肌细胞株AC16 和人胚胎肾293 细胞（hu⁃man embryonic kidney 293 cells，HEK293 细胞）购自ATCC。Primocin（中生瑞泰）；特级澳洲胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；DMEM/F-12 培养基（Hy⁃Clone）；Trizol、逆转录试剂盒、引物、4× SDS Loading Buffer 和Lipofectamine RNAiMAX Transfection Re⁃agent（Invitrogen）；细胞质/细胞核RNA 提取试剂盒（Norgen Biotek）；2× SYBR Green Mix（TaKaRa）；

BCA蛋白定量试剂盒（Thermo）；抗GAPDH抗体（Pro⁃tein Technology）；抗心房钠尿肽（atrial natriuretic pep⁃tide，ANP）抗体（Bioworld）；抗RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，Pol II）和p300 抗体（Abcam）；抗β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗体（Sigma）；ECL 发光液（Millipore）；CDK9siRNA 和miR-199b-5p mimic（广州锐博）；Enzymatic Chroma⁃tin IP Kit（CST）；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1 实验组织 本文共利用22 份健康捐献者心肌组织和26 份心力衰竭患者心肌组织，获取的人心肌组织样品均已完成知情同意，并经广东省人民医院伦理委员会批准（批准号No. GDREC2014066A），手术样品来源于广东省心血管病研究所。

3.2 乳小鼠心肌细胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs）原代分离与培养 取出生1～3 d 的SPF 级的C57BL/6 乳小鼠心脏（每次25 只C57BL/6 乳小鼠，可铺1 板12 孔板细胞）置于洁净的PBS溶液中，去除掉残留血液后转移入50 mL离心管中剪碎。采用0.125%的胰蛋白酶进行消化，反复消化多次后即得含有大量细胞的混悬液。离心后弃去上清，细胞沉淀用完全培养基（含有10%胎牛血清及0.2%Primocin 的DMEM/F-12 培养基）重悬。将重悬液置于75 cm2的培养瓶中，以37℃、5%CO2条件培养1.5～2 h后，根据差速贴壁原理分离NMVCs。将分离得到的NMVCs 以每孔2×105个的量铺入提前用1%明胶包被过的12 孔板中。稳定培养24 h 后更换新的完全培养基，再次稳定培养过夜后即可。

3.3 RT-qPCR 检测miR-199b-5p、CDK9 mRNA 及心肌肥大标志物mRNA 的表达 采用Trizol 法提取出NMVCs 中的总RNA。取1 μg 总RNA 加入4 μL 5×PrimeScript RT Master Mix（含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo-dT Primer 和dNTP Mixture）进行逆转录，得到的cDNA 后用于检测CDK9 和心肌肥大标志物的mRNA 表达水平（以GAPDH 作为检测内参照）。取1 μg 总RNA，加入5 μL 5× PrimeScript RT Buffer、1.25 μL RT Enzyme Mix 和0.2 μL 特异RT 引物进行miRNA 成熟体逆转录，得到成熟体cDNA 后以U6 为检测内参照检测miR-199b-5p 水 平。在ViiA 7 Quantitative PCR Sys⁃tem（Applied Biosystems）进行PCR 和结果分析。以2-ΔΔCt法计算miR-199b-5p、CDK9 mRNA 和心肌肥大标志物mRNA 的相对表达水平。所用引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers used in RT-qPCR

3.4 Western blot 检测蛋白水平 处理后的NMVCs加入RIPA 裂解液进行裂解，裂解后离心，取上清，即得蛋白提取液。取适量蛋白提取液进行蛋白浓度测定，之后进行定量分装，并加入4×loading buffer。涡旋混匀后置于金属浴上99℃变性10 min，-80℃保存。分装变性好的蛋白可进行SDS-PAGE 并转膜至PVDF 膜上，采用5%的脱脂牛奶封闭1 h 。用所需检测蛋白的相应抗体［anti-CDK9（1∶2000），anti-β-MHC（1∶2 000），anti-ANP（1∶1 000），anti-GAPDH（1∶5 000）］对PVDF 膜于4℃孵育过夜。TBST 溶液清洗3 次后用相应Ⅱ抗（1∶5 000）进行孵育，室温孵育1 h。ECL 发光试剂盒显影，以GAPDH 为内参照，FluorChem 8900进行灰度分析。

3.5 双萤光素酶报告基因实验检测CDK9的转录激活及miR-199b-5p与CDK9启动子区的结合 参照我们已报道过的方法［13］，分别构建包含CDK9启动子区（2 kb 序列）、miR-199b-5p 与CDK9启动子潜在结合序列及其突变序列的重组pGL3-enhancer 质粒。使用HEK293 细胞，转染0.5 ng pRL-TK、500 ng 重组质粒及50 nmol/L miR-199b-5p mimic。24 h 后收板，分别测定萤火虫萤光素酶（firefly luciferase，FL）及海肾萤光素酶（Renillaluciferase，RL）的活性，其比值（FL/RL）变化则可反映miR-199b-5p 与CDK9启动子区结合的能力。类似的，利用人心肌AC16 细胞，检测miR-199b-5p对CDK9基因的转录激活作用。

3.6 ChIP-PCR 实验 将转染miR-199b-5p 24 h 的NMVCs 在1%甲醛（Sigma）中37℃孵育15 min，用125 mmol/L 甘氨酸终止反应，超声处理使染色质破碎至100～500 bp的片段。与Pol II和p300结合的内源性DNA 免疫沉淀如下：将30 μL 免疫磁珠与5 μg Pol II/p300 抗体（Abcam，ab32381/ab5408）或5 μg 非特异性山羊IgG（CST，2729）在25℃孵育30 min，IgG作为阴性对照。将超声破碎的4 μg DNA 作为in⁃put DNA，将40 μg 超声破碎的DNA 与抗体珠复合物在25℃孵育40 min，然后进行洗涤步骤，用洗脱缓冲液（1% SDS 和0.1 mol/L NaHCO3）洗脱/Pol II 或p300结合的DNA。用2 mg/L RNA 酶37℃消化1 h，42℃蛋白酶K 消化过夜。纯化洗脱DNA，实时荧光定量PCR检测纯化DNA。实验至少重复3次。

3.7 鬼笔环肽（FITC-phallodin）染色 将NMVCs 提前铺于confocal 皿中，待其稳定生长并处理完毕后，弃去培养基，用PBS 清洗2 次。吸干PBS 后加入500μL 4%多聚甲醛溶液进行固定，室温静置20～30 min。弃去多聚甲醛溶液，加入PBS，置于水平摇床上以50～60 r/min 的转速清洗2～3 次，每次10 min。吸干PBS，加入0.1%TritonX-100透化液500 μL进行透化处理，室温静置3～5 min。弃去Triton X-100 透化液后加入PBS 在水平摇床上漂洗2～3 次，每次10 min。吸干PBS，加入500 μL 用1% BSA 溶液配制的鬼笔环肽工作液，室温避光静置染色60～90 min。染色完毕后弃去鬼笔环肽工作液，加入PBS 清洗3 次，每次5 min。吸干残留PBS 后，每皿滴入3 滴含有DAPI 的封片剂用以封片，并避光收于4℃冰箱，待拍摄。

4 统计学处理

应用SPSS 25.0 软件进行统计分析。数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。两组间均数比较采用t检验；多组间均数比较先进行正态分布和方差齐性检验，方差齐性检验后采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并用Bonferroni 校正的t检验进行组间两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-199b-5p在心衰患者心肌组织中的表达和心肌细胞内的定位

麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色结果显示，心衰患者的心肌细胞面积明显增大，呈现心肌细胞肥大现象（P＜0.01），见图1A。miRNA表达谱芯片与RT-qPCR 检测发现，与健康对照组相比，miR-199b-5p 在心衰患者的心肌组织中表达显著增强，见图1B。为了进一步验证这一结果，我们对多名健康人与心衰患者的心肌组织标本进行RNA 提取，并随后进行RT-qPCR 检测，也得到了一致的结果，见图1C。分离人心肌AC16 细胞的核、质RNA 组分并行miR-199b-5p 水平检测，RT-qPCR 结果显示，GAPDH mRNA 主要分布于AC16 细胞质内，而U6 和miR-199b-5p 主要分布于AC16 细胞核内，见图1D。

2 miR-199b-5p 促进心肌细胞肥大相关基因和CDK9基因的表达

我们用血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）处理原代NMVCs，RT-qPCR 结果显示MYH7 mRNA、ANP mRNA和miR-199b-5p表达水平均明显上调（P＜0.01），见图2A。miR-199b-5p mimic 可被有效转染入NMVCs 中（图2B），且转染入NMVCs 中的miR-199b-5p mimic 主要积累于细胞核内（图2C）。序列分析结果（http：//asia. ensembl. org/）显示，在小鼠miR-199b 前体基因座位与CDK9基因临近，见图2D。RT-qPCR和Western blot结果显示，在转染miR-199b-5p mimic 后的NMVCs 中，ANP、MYH7（mRNA）/β-MHC（蛋白）和CDK9 的表达水平均显著增加，见图2E、F。

Figure 1. The expression of miR-199b-5p in the myocardium of heart failure（HF）patients（n=26）and healthy controls（n=22）. A：the cross-sectional area of cardiomyocytes in human myocardium determined by wheat germ agglutinin（WGA）staining；B：the heat map showed the representative dysregulated miRNAs in the myocardium of HF patients；C：the expression of miR-199b-5p in the myocardium of HF patients detected by RT-qPCR；D：the distribution of miR-199b-5p in cytoplasm and nu⁃cleus of human cardiac AC16 cells（n=5）. Mean±SEM. **P＜0.01 vs healthy controls.图1 miR-199b-5p在心衰病人和健康对照者心肌中表达水平的比较

3 CDK9 介导核miR-199b-5p 促心肌细胞肥大的作用

对NMVCs 分 别 转 染miR-199b-5p mimic 和CDK9 siRNA，鬼笔环肽染色结果显示，miR-199b-5p可显著增加NMVCs 的表面积，而转染CDK9 siRNA后可逆转miR-199b-5p促心肌细胞肥大的作用，见图3A。Western blot 检测结果显示，与对照组相比，转染miR-199b-5p mimic 都能促进NMVCs 中心肌肥大相关蛋白及CDK9 表达增加，而转染CDK9 siRNA 能有效抑制由miR-199b-5p 引起的心肌肥大相关蛋白的表达，见图3B。

4 核 内miR-199b-5p 对NMVCs 中CDK9 基因的转录激活作用

利用构建的含CDK9 基因启动子序列的萤光素酶报告基因载体进行双萤光素酶报告基因实验，结果显示，miR-199b-5p 可特异增强CDK9 基因的转录活性，见图4A。序列分析提示，miR-199b-5p 与小鼠CDK9 基因启动子区的-1164～-1146 位点（TGTCTCCCAAATGCTGGGA）有结合作用。双萤光素酶报告基因实验结果表明，miR-199b-5p 可与CDK9 基因启动子区-1164～-1146 位点结合，而将序列突变（TGTCTCCCAAATCGACCGA）后，miR-199b-5p的结合作用消失，见图4B。ChIP-PCR实验结果显示，miR-199b-5p 促 进NMVCs 中Pol II 和p300 与CDK9基因启动子区的结合作用，见图4C。

Figure 2. miR-199b-5p enhanced the expression of hypertrophy markers and CDK9 in the neonatal mouse ventricular cardiomyocytes（NMVCs）. A：the expression of ANP mRNA，MYH7 mRNA and miR-199b-5p in angiotensin II（Ang II）-treated NMVCs detected by RT-qPCR；B：the level of miR-199b-5p in miR-199b-5p-modified NMVCs；C：the distribution of miR-199b-5p in cytoplasm and nucleus of miR-199b-5p-modified NMVCs；D：gene loci of miR-199b and CDK9 in mouse genome；E：the mRNA expression of ANP，MYH7 and CDK9 in miR-199b-5p-treated NMVCs detected by RT-qPCR；F：the protein ex⁃pression of ANP，β-MHC and CDK9 in miR-199b-5p-treated NMVCs detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. ##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs scrambled group.图2 miR-199b-5p可增强NMVCs中心肌肥大标志物和CDK9的表达

讨 论

研究发现，利用心肌特异表达的“分子海绵”结合并阻断miR-199a/199b-5p 的作用，可增加小鼠心脏重量，但心脏形态和功能正常，机制研究提示PGC1α 介导了miR-199a/199b-5p 降低引起的生理性心肌肥大过程［14］。也有研究发现，miR-199b-5p在心衰的人和小鼠心肌及心梗后的小鼠心肌中表达升高，miR-199b-5p 靶向抑制Dyrk1a、Notch1 受体及其Jagged1 配体表达，从而加剧心肌肥大和心肌纤维化［15-16］。与以往研究一致，在本研究中，我们证实miR-199b-5p 在心衰患者心肌组织中表达增强，转染miR-199b-5p mimic 可增加ANP 和β-MHC 等心肌肥大标志物的表达，具有促进心肌细胞肥大的作用。

Figure 3. Knock-down of CDK9 inhibited the pro-hypertrophy effect of miR-199b-5p on NMVCs. A：morphological changes of NMVCs observed by FITC-phalloidin staining（scale bar=50 μm）；B：the protein expression of ANP，β-MHC and CDK9 in NMVCs detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs scrambled group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs miR-199b-5p+si-NC group.图3 敲减CDK9可抑制miR-199b-5p促心肌细胞肥大的作用

既往RNA 深度测序的研究显示，细胞质和细胞核中有多种miRNA 的特征性定位分布［17］。miRNA的不同细胞定位可能会导致截然不同的生物学功能，但具体机制尚不完全清楚［18］。随着miRNA 相关研究的深入，越来越多的证据显示在某些特定情况下miRNA 能够促进基因的表达和转录［19-23］。在本研究中，我们发现miR-199b-5p 在心肌细胞核内富集，miR-199b-5p mimic 可 以 特 异 增 加 与miR-199b-5p 前体基因临近的CDK9基因的转录激活和表达，而敲减CDK9表达可逆转miR-199b-5p促进心肌细胞肥大的作用，提示CDK9 介导了miR-199b-5p 促心肌细胞肥大作用。

CDK9 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞转录过程中起着重要的作用［24］。心肌肥大通常伴随着cyclin T/CDK9 的激活，心脏特异性的细胞周期蛋白T1 激活CDK9 则可引起心肌肥大；通过敲减7SK RNA 表达或过表达cyclin T1 从而激活CDK9 均能产生体内外的致心肌细胞肥大作用［25-26］。研究证实，CDK9转基因小鼠会发生心肌肥大，CDK9与Gq依赖性的心肌肥大通路相互作用，损害多种线粒体蛋白基因表达，特别是抑制线粒体生物发生和功能的主调节因子PGC-1 和NRF-1，进而参与心肌肥大和线粒体功能障碍过程［27］。

本研究证实，miR-199b-5p可通过转录激活的方式增强CDK9基因表达，我们还鉴定了miR-199b-5p与CDK9基因启动子区的结合位点，并进一步通过ChIP-PCR 证实Pol II 和p300 可以募集到miR-199b-5p 与CDK9基因启动子区的结合位点上，并参与CDK9基因的转录激活，进而引发NMVCs 出现肥大表型。因此，本研究结果表明，与心肌细胞胞质中miR-199b-5p 的作用方式不同，核内miR-199b-5p 是通过转录激活CDK9基因的方式引起心肌肥大相关基因表达增强的。同时，这些结果也表明心肌细胞胞质/胞核中miR-199b-5p 通过不同的分子机制来协同促进心肌肥大的作用。

Figure 4. miR-199b-5p enhanced the transcription of CDK9 gene. A：miR-199b-5p enhanced CDK9 transcription activity（detected by dual-luciferase reporter assay）；B：identification of the interaction between miR-199b-5p and CDK9 gene promoter by dual-luciferase reporter assay；C：ChIP-PCR for detecting RNA polymerase II（Pol II）and p300 on CDK9 gene promoter in miR-199b-5p-modified NMVCs. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs scrambled group；△△P＜0.01 vs group a；##P＜0.01 vs group c.图4 miR-199b-5p增强CDK9基因的转录激活

本研究明确NMVCs 核内miR-199b-5p 可特异性增强CDK9基因的表达，证实CDK9 可介导核内miR-199b-5p 促心肌细胞肥大的作用。在后续研究中，我们将进一步在整体动物水平明确miR-199b-5p 通过调控CDK9基因表达发挥促心肌肥大的作用机制。