Toll样受体4介导的自噬减轻糖基化高密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡*

王晓旭， 田 华， 于 飞， 闫京锐， 刘庆华， 潘天琦，焦 鹏， 秦树存△， 姚树桐△

［山东第一医科大学（山东省医学科学院） 1基础医学院，2动脉粥样硬化研究所，山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，3第二附属医院，山东泰安271000；4山东中医药大学中医学院，山东济南250355］

以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为病理基础的心脑血管疾病是糖尿病患者的主要并发症，其发病率是非糖尿病患者的4～8 倍［1］。糖尿病患者体内的蛋白质等大分子的氨基与葡萄糖的醛基反应生成晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end product，AGE），可导致动脉内皮功能障碍［2］，并通过活化巨噬细胞、上调氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）受体表达和增强ox-LDL的摄取参与AS 泡沫细胞的形成［3］。血脂异常，尤其ox-LDL 被认为是AS 发生发展的独立危险因素，而LDL 不仅易被氧化修饰，而且在高糖环境中可被糖基化修饰，形成糖基化LDL（glycosylated LDL，gly-LDL），并在AGE 受体（receptor for AGE，RAGE）和清道夫受体介导下被巨噬细胞大量摄取形成泡沫细胞［2，4-5］。高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）是一种抗AS 血浆脂蛋白，具有胆固醇逆向转运、抗炎、抗氧化等功能。糖尿病患者体内糖基化HDL（glycosylated HDL，gly-HDL）水平较正常人显著升高，使其抗AS 作用显著减弱，并可诱导血管内皮细胞和巨噬细胞凋亡，但其机制尚未完全阐明。

近年来研究证明，内质网应激介导的细胞凋亡在AS 发生发展中发挥着重要作用，并与自噬存在着交互作用。本课题组前期证实，自噬通过抑制C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）介导的内质网应激凋亡途径减轻ox-LDL 所诱导的巨噬细胞凋亡［6-7］，但是gly-HDL 是否通过激活内质网应激凋亡途径减轻血管内皮细胞凋亡以及自噬在其中的作用和分子机制尚不清楚。本项工作通过体外培养血管内皮细胞，探讨gly-HDL 对自噬和cas⁃pase-12介导的内质网应激凋亡途径的影响及其相互关系，并观察Toll 样 受 体4（Toll-like receptor 4，TLR4）在其中的作用，以进一步阐明gly-HDL 导致血管内皮损伤的机制，为糖尿病AS 的发病机制及防治提供参考资料。

材料和方法

1 材料与试剂

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endo⁃thelial cells，HUVECs）购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。羧甲基赖氨酸（car⁃boxymethyl lysine，CML）ELISA 试 剂 盒 购 自Blue⁃Gene；DMEM 高糖培养液和胎牛血清购自Gibco；RIPA 裂解液购自Solarbio；小鼠抗人TLR4 和兔抗人caspase-12 抗体分别购自eBioscience 和Abcam；兔抗人beclin-1 和微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-as⁃sociated protein 1 light chain 3，LC3）抗体购自Cell Signaling Technology；雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和兔抗β-actin 抗体购自Sig⁃ma；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和抗小鼠IgG 以及Alexa Fluor 488 标记驴抗兔II 抗分别购自北京中杉金桥和Molecular Probes；MTT 和AnnexinV-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡测定试剂盒分别购自Genview 和南京凯基公司；ECL 化学发光试剂盒和PVDF 膜分别购自Pierce 和Millpore；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。

2 方法

2.1 HDL 的提取与糖基化［8］健康人新鲜血浆HDL（1 063～1 210 g/L）采用序列超速离心法分离，在含1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的磷 酸盐缓 冲液（phosphatebuffered saline，PBS；pH 7.4）中4℃透析，过滤除菌。将正常HDL（2 g/L）与50 mmol/L 葡萄糖在含有2 mmol/L EDTA 并充入氮气的PBS 中无菌避光条件下37℃孵育7 d，然后在含有1 mmol/L EDTA 的PBS（pH 7.4）中充分透析以去除游离葡萄糖。另取HDL在不含糖的相同条件下处理作为正常对照。采用ELISA 法测定CML 的含量反映HDL 的糖基化程度。gly-HDL 中CML 水平［（197.9±56.9）ng/（g protein）］显著高于HDL［（55.5±10.8）ng/（g protein）］，表明gly-HDL制备成功。

2.2 细胞培养与实验分组 HUVECs 用含10%胎牛 血 清、1×105U/L 青 霉 素 和100 mg/L 链 霉 素 的DMEM 高糖培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养。随机分为如下6 组：（1）正常对照（control）组：培养液常规培养；（2）正常HDL 组：培养液中加入100 mg/L的HDL；（3）gly-HDL 组：培养液中加入不同浓度（25、50 和100 mg/L）的gly-HDL；（4）自噬诱导剂雷帕霉素预处理组（gly-HDL+rapamycin 组）：培养液中先加入1 μmol/L rapamycin 预处理1 h，再加入100 mg/L gly-HDL；（5）自噬抑制剂3-MA 预处理组（gly-HDL+3-MA 组）：培养液中先加入2 mmol/L 3-MA 预处理1 h，再加入100 mg/L gly-HDL；（6）抗TLR4单抗预处理组（gly-HDL+ TLR4 Ab 组）：培养液中先加入5 mg/L 抗TLR4 单抗预处理30 min，再加入100 mg/L gly-HDL。加入HDL 或gly-HDL 后继续培养24 h 并收集细胞。

2.3 细胞活力和LDH 测定 将细胞接种于96 孔板，按分组加药处理后，依据既往报道的MTT分析方法检测细胞活力［6］。以正常对照组细胞活力为100%，其余各组细胞活力以其吸光度（A）值占对照组A 值的百分比表示。培养液LDH 活性，需留取培养液上清液按照试剂盒说明书操作。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞经分组加药处理后，按照试剂盒说明书收集并重悬于500 μL binding buffer 中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 室温避光孵育15 min。细胞凋亡率用流式细胞仪（Becton Dickinson）分析测定。总细胞凋亡率（%）=［早期凋亡率（Annexin V+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin V+/PI+）］×100%。

2.5 Western blot分析 细胞经分组加药处理后，按照既往报道的方法［7］提取各组细胞蛋白，经蛋白定量，凝胶电泳，电转印至PVDF 膜，使用5%脱脂奶粉封闭，分别用兔抗beclin-1、caspase-12、TLR4 和β-ac⁃tinⅠ抗抗体4℃孵育过夜，洗膜，用辣根过氧化物酶标记相应Ⅱ抗孵育2 h。免疫条带用ECL 法显示，应用化学发光成像系统（上海欧翔科学仪器有限公司，Chemi Q4800mini 型）进行图像采集，采用Image-Pro Plus 软件分析蛋白条带积分吸光度（integrated absor⁃bance，IA）值，以靶蛋白/β-actin IA 值的比值反映靶蛋白相对水平。

2.6 免疫荧光细胞化学法检测LC3 表达 将细胞接种于放有无菌盖玻片的6 孔培养板内，细胞经分组加药处理后，PBS 润洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 润洗，0.1% Triton-X 100 室温处理4 min，10%驴血清封闭，滴加1∶100 稀释的兔抗LC3 抗体，4℃过夜。PBS 润洗后，滴加Alexa Fluor 488 标记的驴抗兔Ⅱ抗（1∶1 000），37℃孵育30 min，并以DAPI复染细胞核（蓝色），PBS 充分润洗后，抗淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜（Nikon）下观察，LC3 阳性表达呈绿色，呈颗粒状聚集表明发生自噬反应。

3 统计学处理

计量数据用均数±标准差（mean±SD）表示。用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 雷帕霉素和3-MA 对gly-HDL 诱导的HUVECs损伤的影响

与正常对照组HUVECs 比较，gly-HDL 处理组自噬关键分子beclin-1 表达显著上调（P＜0.05）；与gly-HDL 处理组比较，自噬诱导剂雷帕霉素进一步上调beclin-1表达，而自噬抑制剂3-MA 可拮抗gly-HDL对beclin-1 的诱导作用（P＜0.05），见图1A。gly-HDL 处理组细胞损伤明显，表现为细胞活力减弱、LDH 漏出增加（P＜0.01），雷帕霉素可显著减轻gly-HDL 所造成的细胞活力降低和LDH 漏出（P＜0.05），而3-MA则进一步加重gly-HDL 所造成的细胞损伤和LDH 漏出（P＜0.05），见图1B、C。

2 雷帕霉素和3-MA 对gly-HDL 诱导的HUVECs凋亡的影响

gly-HDL组相比正常对照组凋亡率显著增加（P＜0.01）；雷帕霉素预处理组较gly-HDL 组细胞凋亡率显著减少（P＜0.05），而3-MA 预处理组凋亡率则较gly-HDL组显著增加（P＜0.05）。见图2。

3 雷帕霉素和3-MA 对HUVECs 中caspase-12 表达的影响

Figure 1. Effects of rapamycin and 3-MA on the injury of HUVECs induced by gly-HDL. The cells were pretreated with or without ra⁃pamycin（1 μmol/L）or 3-MA（2 mmol/L）for 1 h and then stimulated with gly-HDL（100 mg/L）for 24 h. A：the protein level of beclin-1 determined by Western blot；B：cell viability determined by MTT assay；C：LDH activity in the media.Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.图1 雷帕霉素和3-MA对gly-HDL诱导的HUVECs损伤的影响

Figure 2. Effects of rapamycin and 3-MA on apoptosis of HUVECs induced by gly-HDL. Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.图2 雷帕霉素和3-MA对gly-HDL诱导的HUVECs凋亡的影响

caspase-12 作为介导内质网应激凋亡途径的重要分子之一，可通过检测caspase-12 剪切活化形式（cleaved caspase-12）来显示caspase-12 的活化程度。结果显示，cleaved caspase-12在gly-HDL组较正常对照组水平显著增加（P＜0.05），雷帕霉素预处理组cleaved caspase-12的水平较gly-HDL 组显著减少（P＜0.05），而3-MA 预处理组cleaved caspase-12 的水平则较gly-HDL组进一步上调（P＜0.05），见图3。

4 gly-HDL 上调HUVECs 中TLR4 表达并激活自噬

与对照组相比，gly-HDL 显著上调TLR4 和be⁃clin-1 的表达，尤其以100 mg/L 浓度处理组最显著（P＜0.01），同时可显著促进自噬标志分子LC3聚集、颗粒化（P＜0.01）；100 mg/L HDL 处理组beclin-1 和TLR4的表达与对照组比较未见显著差异，见图4。

5 TLR4 中和抗体抑制gly-HDL 诱导的HUVECs自噬

TLR4 中和抗体预处理组较gly-HDL 组beclin-1表达有所降低（P＜0.05），见图5A；且与gly-HDL处理组比较，TLR4中和抗体预处理组LC3颗粒化程度减弱（P＜0.01），见图5。

Figure 3. Effects of rapamycin and 3-MA on caspase-12 expression in HUVECs. The cells were treated as described in Figure 1，and then the protein levels of caspase-12 were evaluated by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.图3 雷帕霉素和3-MA对HUVECs中caspase-12表达的影响

Figure 4. gly-HDL up-regulated TLR4 expression and activated autophagy in HUVECs. The HUVECs were treated with the indicated dose of gly-HDL and HDL（100 mg/L）for 24 h. A：the protein levels of TLR4 and beclin-1 were analyzed by Western blot；B：the protein level of LC3-II was analyzed by Western blot；C：immunofluorescence experiments showed LC3 la⁃beled by Alexa Fluor 488（green）and nuclei visualized by DAPI（blue）. Representative fluorescence images were photo⁃graphed by a laser scanning confocal microscope and autophagosomal puncta per cell were quantified. Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图4 gly-HDL上调HUVECs中TLR4表达并激活自噬

Figure 5. Anti-TLR4 antibody inhibited gly-HDL-induced autophagy in HUVECs. The cells were preincubated with 5 mg/L of TLR4 neutralizing antibody（TLR4 Ab）for 30 min and then treated with 100 mg/L gly-HDL for 24 h. Beclin-1 level（A）and LC3 puncta（B）were determined by Western blotting and immunofluorescence experiments，respectively. Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs gly-HDLgroup.图5 TLR4中和抗体抑制gly-HDL诱导的HUVECs自噬

讨 论

自噬是细胞将受损的蛋白质、细胞器运输至溶酶体进行自我消化降解的过程，是细胞维持内环境稳态的重要机制之一［9］。文献报道糖尿病患者血浆中自噬标志物自噬相关基因7（autophagy-associated gene 7，ATG-7）和beclin-1 的水平明显高于健康人［10］，且ATG-7敲除小鼠胰岛β细胞数目和胰岛素分泌量减少［11-12］，继而发生高血糖；LDLR-/-且巨噬细胞ATG-5缺陷小鼠氧化应激反应增强，活性氧生成明显增多，加速了AS 斑块的进展［13］，表明自噬功能失调与糖尿病及AS 的发生发展密切相关。ox-LDL 和AGE 均可触发血管内皮细胞发生自噬反应，而自噬水平的上调可减轻ox-LDL 和AGE 所诱导的LDH 漏出和内皮素表达，提示自噬的发生可减轻血管内皮细胞损伤和炎症反应［14］。本实验结果显示，gly-HDL处理后的HUVECs 自噬标志分子beclin-1 和LC3-II上调且LC3 颗粒化明显，表明HDL 糖基化修饰后可诱导血管内皮细胞自噬；且gly-HDL 所诱导的HU⁃VECs 损伤和凋亡可被自噬诱导剂雷帕霉素减弱，而被自噬抑制剂3-MA 进一步加重，提示自噬在一定程度上可以减轻gly-HDL 所导致的血管内皮细胞损伤和凋亡。

血管内皮细胞损伤、凋亡导致血管内膜完整性被破坏，有利于氧化、糖基化修饰脂蛋白进入内膜下，刺激炎症反应，促进血栓形成，加速粥样斑块进程，因此血管内皮细胞损伤是AS 发生发展的始动环节。越来越多研究表明，内质网应激在AS 的发生发展中起关键作用［15］，尤其CHOP 和caspase-12 介导的内质网应激凋亡途径介导的细胞凋亡参与AS 早期和晚期整个发展过程，并在易损斑块的形成和破裂进而导致急性心脑血管事件的发生中具有重要作用［16］。本课题组前期研究表明，晚期糖基化白蛋白［17］、糖尿病患者的ox-LDL［18］都可通过激活caspase-12途径诱导巨噬细胞凋亡［19］。本实验结果显示，gly-HDL 处理组caspase-12 活性和HUVECs 凋亡率均较对照组显著增加，提示caspase-12 可介导gly-HDL 所诱导的HUVECs凋亡。

近年来研究表明，自噬与内质网应激存在交互作用，并参与AS 的发生发展［20］。自噬可在一定程度上减弱内质网应激反应强度，维持细胞内稳态和功能，减轻细胞损伤和凋亡［21］。在小鼠缺血/再灌注肾损伤模型中，肾小管上皮细胞中内质网应激标志蛋白糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）及CHOP 和caspase-12 等表达明显增多，自噬诱导剂可抑制以上蛋白的表达，并减少细胞凋亡，而自噬抑制剂氯喹或3-MA 则进一步上调CHOP 和caspase-12 表达，加重了细胞凋亡［22］。本课题组既往研究证实，3-MA可促进ox-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡和CHOP 上调，而雷帕霉素则拮抗了ox-LDL 所诱导的细胞凋亡［6］。本实验结果显示，3-MA 可加重gly-HDL 所诱导的HUVECs 损伤及凋亡，并进一步增强caspase-12活性，而雷帕霉素则减轻了细胞损伤及凋亡，抑制了caspase-12 活化，提示自噬可以通过拮抗caspase-12 所介导的内质网应激凋亡途径来减轻gly-HDL所致的血管内皮细胞凋亡。

TLR4 是调控炎症反应和氧化应激反应的重要信号分子，在心血管疾病的发生发展中具有重要作用［23］。除了微生物、内毒素等配体外，TLR4 还可识别轻度和重度氧化修饰的LDL 等致AS 因子，促进巨噬细胞脂质的蓄积［24-26］。TLR4缺乏可抑制泡沫细胞形成，减少ApoE-/-小鼠炎症因子表达［27］。本课题组既往研究证实，TLR4 可介导轻度氧化修饰的LDL 所导致的巨噬细胞内脂质蓄积，进而激活内质网应激反应，并在ox-HDL 所诱导的CHOP 信号途径活化进而导致巨噬细胞凋亡过程中具有重要作用［28］。本实验结果显示，gly-HDL 处理HUVECs 24 h 后，TLR4表达显著上调，而给予TLR4中和抗体预处理拮抗其生物活性，则可明显抑制gly-HDL 所诱导的beclin-1上调和LC3 颗粒化，提示gly-HDL 可能是通过上调TLR4 来诱导HUVECs 自噬反应的，而对于TLR4 在其中的具体分子机制正在深入研究中。

综上所述，本体外细胞实验结果表明TLR4 介导gly-HDL 所诱导的HUVECs 自噬反应，而一定程度的自噬可减轻gly-HDL 所诱导的HUVECs凋亡，其机制可能与抑制caspase-12 所介导的内质网应激凋亡途径有关。