AT1-AA通过上调细胞自噬诱导大鼠心功能不全*

张志楠， 康晓庆， 王 瑾， 靳文文， 王雪娇， 焦向英△

（1山西医科大学生理学教研室，山西太原030001；2山西省心血管病医院，山西太原030024）

心血管疾病是我国乃至全世界最常见的疾病之一，多数患者最后可转为慢性心力衰竭而导致死亡［1-2］。心肌细胞属于终末分化细胞，在心力衰竭的发展进程中，各种致病原因引起的心肌细胞凋亡使得有功能的细胞数目逐渐减少，引起心功能逐渐下降，直至最后无法代偿而出现心力衰竭［3-4］，因此抑制心肌细胞凋亡可以有效延缓心功能不全的发生，是治疗心力衰竭的重要策略［4-5］。近年来的研究表明，在各类心血管类疾病（包括心衰）患者血清中均检测到血管紧张素Ⅱ1 型受体自身抗体（angiotensin Ⅱtype 1 receptor autoantibody，AT1-AA），其水平明显高于正常人［6-7］，提示AT1-AA 可能参与心力衰竭进程，但在整体情况下，该抗体是否可以诱导心肌细胞凋亡引起心功能不全及其具体机制尚不清楚。

细胞自噬是真核细胞蛋白降解的途径之一，通常被认为是细胞的一种正常保护机制，是维持细胞稳态所必需的［8］。在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生（如神经退行性疾病和肿瘤）；饥饿等也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量来促进细胞存活［9］。然而，过多的和不受控制的自噬激活会导致必需分子和细胞器的耗竭，引起细胞凋亡［10-11］。这表明，自噬具有双向功能，根据诱导的背景和程度不同，它可能会拮抗疾病的发病机制，也可能促进疾病的进展［12］。自噬与心血管疾病密切相关，在心力衰竭进程中发挥着多种作用［13-14］。已证实，血管紧张素Ⅱ（angiotension Ⅱ，Ang Ⅱ）可以诱导自噬［15-16］，AT1-AA 具有类Ang Ⅱ的激动样作用［17］，那么AT1-AA 是否也会对心肌细胞的自噬产生影响，如果有影响，自噬在AT1-AA引起的心功能不全及心肌细胞凋亡中的作用如何，值得我们深入探讨。

研究发现，AT1-AA 是一种G 蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptor，GPCR）自身抗体，可以特异性结合血管紧张素Ⅱ1 型受体（angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AT1R），通过专一性识别AT1R 细胞外第二环（the second extracellular loop of AT1R，AT1R-ECⅡ）功能表位肽段而发挥类Ang Ⅱ激动效应［18］。因此，我们猜测AT1-AA 可能通过与AT1R 结合引起心功能不全。因此，本研究的主要目的是观察AT1-AA是否通过AT1R，使大鼠心肌细胞自噬上调，诱导在体大鼠心肌细胞凋亡，进而引起心功能不全，参与心力衰竭的进程。

材料和方法

1 动物和材料

SD 大鼠和AT1aR基因敲除8 周龄雄性SD 大鼠，由首都医科大学刘慧荣教授赠送（南京大学-南京生物医药研究院制备）。PCR 引物购于上海生工生物工程股份有限公司，具体序列见表1；AT1R-ECⅡ（序列 为165～191，IHRNVFFIENTNITVCAFHYESQN⁃STL）肽段购于上海吉尔生化公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购于Bio-Rad；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和HE检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、beclin-1、P62、caspase-3和β-actin抗体购于CST。

表1 PCR引物序列Table 1. Primer sequences for PCR

2 实验方法

2.1 实验动物分组 PCR 基因鉴定后分组，分为空白对照（vehicle）组、AT1-AA 免疫（AT1-AA）组、AT1-AA+3-MA 组和AT1aR-/-+AT1-AA 组。前3 组为8 周龄雄性SD大鼠（AT1aR基因敲除SD大鼠子代中阴性纯合子），第4 组为8 周龄雄性AT1aR基因敲除鼠，每组6 只。除空白对照组大鼠外，其余大鼠均进行首次免疫［将人同源性AT1R-ECⅡ肽段（0.4 μg/g）溶于Na2CO3稀释溶液溶解，与完全弗氏佐剂1∶1 混匀后，多点背部皮下注射］及加强免疫（将完全佐剂换为不完全弗氏佐剂，每2 周1 次，共免疫12 周），每次加强免疫前从尾静脉取血，留取大鼠血清；vehicle 组将抗原溶液换位等量Na2CO3溶液，其余同免疫组。AT1-AA+3-MA组，免疫8周时从AT1-AA免疫组随机分出6只腹腔注射3-MA（10 mg/kg），隔天1次，共4周。

2.2 SA-ELISA 法检测血清抗体水平 用人工生物合成的AT1R-ECⅡ抗原肽段包被抗原于96 孔板，4℃过夜。加入封闭液，37℃水浴箱中封闭1 h，PBST 溶液清洗。37℃水浴1.5 h 孵育I 抗，PBST 溶液清洗，静置风干。37℃水浴孵育Ⅱ抗羊抗大鼠IgG 1 h，PBST 溶液清洗。加链酶卵白素37℃水浴箱1 h，PBST 溶液清洗。加入底物ABTS 缓冲液水浴箱中30 min 显色。用酶标仪检测吸光度（A）值，得到血清抗体浓度。

2.3 小动物超声仪检测心脏结构和功能的变化异氟烷轻度麻醉大鼠，左侧前胸脱毛。GE Vivid 7 Dimension Ultrasound 超声仪进行超声心动图检查，取短轴切面。测定左心室舒张末期内径（left ven⁃tricular end-diastolic inner dimension，LVIDd）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic inner diameter，LVIDs）、左心室舒张末期后壁厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LPWDd）、左心室收缩末期后壁厚度（left ventricular end-systolic posterior wall thickness，LPWDs）、左心室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）和左心室收缩末期容积（left ventricular endsystolic volume，LVESV）作为反映心脏结构的指标。测定左心室射血分数（left ventricular ejection frac⁃tion，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）作为反映心脏功能的指标。连续测量3次，取平均值。

2.4 HE 染色 采用4%多聚甲醛固定和石蜡包埋的大鼠心脏。取左室横切面3 μm 连续切片，常规苏木精-伊红（HE）染色。Olympus BX51 正置显微镜获取图像。

2.5 TUNEL 染色检测心脏组织细胞凋亡情况 将石蜡包埋的心脏组织左室横切面2 μm 连续切片，根据TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作检测。Olympus BX51正置显微镜获取图像。心肌细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）=凋亡心肌细胞核数/心肌细胞核总数×100%。

2.6 Western blot 检测自噬和凋亡相关蛋白水平分别检测自噬起始的重要调节因子beclin-1、自噬体形成的标志蛋白LC3 及自噬底物P62 的表达和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 的水平。取0.05 g 心脏组织，加500 μL 裂解液和5 μL 蛋白酶抑制剂PMSF，眼科剪剪碎后超声碎裂，冰上裂解2.5 h，12 000 r/min、4℃离心15 min，取上清。BCA 法测蛋白浓度，SDS-PAGE 分离，转膜，封闭，I 抗和Ⅱ抗孵育，滴加ECL 发光液曝光。ImageJ 软件分析曝光条带灰度值。以β-actin作为蛋白表达的内参照。

3 统计学处理

用SPSS 16.0 和GraphPad Prism 6.02 软件进行统计分析。数据均以均数±标准误（mean±SEM）表示。两组间比较使用独立样本t检验；多组间比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较使用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AT1-AA阳性大鼠模型的建立

SA-ELISA 方法检测大鼠血清中的AT1-AA 水平。结果显示，与vehicle 组相比，AT1-AA 免疫组免疫第2 周时血清AT1-AA 含量升高（P＜0.05），随着免疫时间延长，血清中AT1-AA 抗体滴度逐渐升高，免疫8 周时AT1-AA 抗体滴度达到峰值并到实验结束一直维持在高水平（P＜0.01），提示AT1-AA 阳性大鼠造模成功，见图1A。

PCR 鉴定不同基因型大鼠DNA 的水平。图1B结果显示，1和2为SD 大鼠（AT1aR 基因敲除SD 大鼠子代中阴性纯合子），3 和4 为AT1aR 基因敲除SD 大鼠子代中阳性杂合子，5 为AT1aR 基因敲除SD 大鼠子代中阳性纯合子。

2 AT1-AA 长期存在可以引起大鼠心肌损伤、心功能下降及心脏结构的改变

心脏超声结果图见图2A，与vehicle 组相比，AT1-AA 免疫组大鼠在免疫12 周时的LVIDs 和LVESV 均显著增加（P＜0.05），LVEF 和LVFS 均明显下降（P＜0.05），见图2。

HE 染色结果显示，vehicle 组心肌细胞排列整齐，细胞致密，细胞核大小均一，横纹清晰，细胞间隙正常，心肌纤维未见明显断裂。与vehicle 对照组相比，AT1-AA 免疫组大鼠在免疫12 周时心肌细胞排列紊乱，细胞核大小明显不同，细胞质空泡化，横纹模糊，细胞间隙扭曲增宽，心肌纤维走向紊乱且破裂，见图2J。

以上结果提示AT1-AA 长期存在可以引起大鼠心肌损伤、心功能下降及心脏结构改变。

3 AT1-AA长期存在可以引起心肌细胞凋亡增加

TUNEL 染色结果显示，与vehicle 组相比，在免疫12 周时免疫组大鼠心脏组织中TUNEL 染色阳性即棕黄色细胞核增多，心肌细胞凋亡指数增加（P＜0.05），见图3A。

Western blot 检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 的水平，结果显示：与vehicle 组相比，AT1-AA 免疫组在免疫12 周时心脏组织的cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平增加（P＜0.05），说明凋亡水平上升，见图3C。以上结果提示AT1-AA 长期存在可以诱导心脏组织凋亡增加。

Figure 1. AT1-AA positive rats were successfully established. A：characteristics of AT1-AA in serum. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs vehicle group. B：PCR results for AT1aR knockout rats. M：marker；P：positive control；1，2：AT1aR-/- mice；3，4：AT1aR-/+mice；5：AT1aR+/+mice.图1 AT1-AA阳性大鼠造模成功的鉴定结果

4 AT1-AA 长期存在可以引起心脏组织自噬水平升高

Western blot 检测自噬相关蛋白LC3、beclin-1 和P62 的蛋白表达。结果显示与vehicle 组相比，AT1-AA 免疫组在免疫12周时心脏组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1 蛋白的水平增加（P＜0.05），而P62 蛋白的水平降低（P＜0.05），见图4。提示AT1-AA 可以诱导心脏组织细胞自噬水平升高。

5 自噬抑制剂3-MA可以抑制AT1-AA诱导的大鼠心脏组织细胞自噬和凋亡水平，改善心功能不全

腹腔注射3-MA 4 周后，取大鼠心脏组织用Western blot 检测自噬相关蛋白的表达水平。结果显示与AT1-AA免疫组相比，AT1-AA+3-MA组心脏组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1 蛋白的水平降低（P＜0.05），而P62 蛋白的水平升高（P＜0.05），见图4，提示自噬抑制剂3-MA可以抑制AT1-AA诱导的大鼠心脏组织细胞自噬水平。

腹腔注射3-MA 4 周后，TUNEL 染色检测心脏组织细胞凋亡情况，Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达水平。TUNEL 染色结果显示，与AT1-AA 免疫组相比，AT1-AA+3-MA 组大鼠心脏组织棕黄色颗粒较少，心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05），见图3A；Western blot 结果显示与AT1-AA 组相比，AT1-AA+3-MA 组心脏组织的cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平下降（P＜0.05），说明凋亡减少，见图3B。以上结果提示抑制自噬可减少AT1-AA 诱导的心脏组织细胞凋亡。

小动物超声仪检测心脏功能和结构变化，HE 染色观察心脏结构变化。超声检测结果显示，与AT1-AA 免疫 组相 比，AT1-AA+3-MA 组大鼠 的LVIDs 和LVESV 均下降（P＜0.05），LVEF 和LVFS 均显著增加（P＜0.05），见图2。HE 染色结果显示，与AT1-AA 免疫组相比，AT1-AA+3-MA 组心肌细胞排列紊乱减少，细胞质空泡化减少，横纹较清晰，细胞间隙扭曲增宽程度降低，心肌纤维走向紊乱且破裂程度较轻，心肌细胞溶解减少，见图2J。以上结果提示自噬抑制剂3-MA 可以减轻AT1-AA 诱导的大鼠心肌损伤、心脏结构改变及心功能不全。

6 AT1aR 敲除可以使AT1-AA 诱导的心脏组织自噬和凋亡水平降低，心功能不全改善

AT1aR敲除鼠主动免疫12 周时，Western blot 检测大鼠心脏组织自噬相关蛋白的表达水平。结果显示与AT1-AA 免疫组相比，AT1aR-/-+AT1-AA 组心脏组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1 蛋白的水平降低（P＜0.05），而P62 蛋白的水平则升高（P＜0.05），见图4，提示敲除AT1aR可以使AT1-AA 诱导的大鼠心脏组织细胞自噬水平降低。

Figure 2. AT1-AA positive rats had decreased cardiac function and damaged heart structure，and both autophagy inhibitor 3-MA and AT1a receptor knockout reduced the functional and structural damages of heart and attenuated cardiac insufficiency in the rats. A：the images of representative of echocardiography；B：left ventricular end-systolic inner diameter（LVIDs）；C：left ventricular end-systolic volume（LVESV）；D：left ventricular ejection fraction（LVEF）；E：left ventricular fraction shortening（LVFS）；F：left ventricular end-diastolic inner diameter（LVIDd）；G：left ventricular end-diastolic volame（LVEDV）；H：left ventricular end-systolic wall thickness（LPWDs）；I：left ventricular end-diastolic wall thickness（LPWDd）；J：the results of HE staining（scale bar=200 μm）. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs vehicle group；#P＜0.05 vs AT1-AA group.图2 AT1-AA阳性大鼠心脏功能下降和结构损伤，自噬抑制剂3-MA和AT1aR敲除都可以减轻大鼠心脏功能和结构损伤，改善心功能不全

AT1aR敲除鼠主动免疫12 周时，TUNEL 染色和Western blot 检测心脏组织细胞凋亡情况。TUNEL染色结果显示，与AT1-AA 免疫组相比，AT1aR-/-+AT1-AA 组大鼠心脏组织棕黄色颗粒较少，心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05），见图3A。Western blot 结果显示与AT1-AA 组相比，AT1aR-/-+AT1-AA 组心脏组织凋亡相关蛋白cleaved caspase-3/caspase-3 的水平下降（P＜0.05），见图3B，说明凋亡水平下降，提示敲除AT1aR可减轻AT1-AA 诱导的心脏组织细胞凋亡水平。

Figure 3. The apoptosis of AT1-AA positive rat heart tissue was increased，and both autophagy inhibitor 3-MA and AT1aR knockout reduced the apoptosis induced by AT1-AA in heart tissue. A：results of TUNEL staining（the scale bar=200 μm）；B：the protein levels of caspase-3 protein in different rat heart tissues determined by Western blot. Mean±SEM. n=6. * P＜0.05 vs vehicle group；#P＜0.05 vs AT1-AA group.图3 AT1-AA阳性大鼠心脏组织细胞凋亡增加，自噬抑制剂3-MA和AT1aR敲除均可降低AT1-AA诱导的心脏组织细胞凋亡

AT1aR敲除鼠主动免疫12 周时，小动物超声检测心脏功能和结构变化，HE 染色观察心脏结构变化。超声检测结果显示，与AT1-AA 免疫组相比，AT1aR-/-+AT1-AA 组大鼠的LVIDs 和LVESV 均下降（P＜0.05），LVEF 和LVFS 均显著增加（P＜0.05），见图2。HE 染色结果显示，与AT1-AA 免疫组相比，AT1aR-/-+AT1-AA 组大鼠的心肌细胞排列紊乱减轻，横纹较清晰，细胞间隙扭曲增宽程度降低，心肌纤维走向紊乱且破裂程度较轻，见图2J。以上结果提示AT1aR敲除可以使AT1-AA 诱导的大鼠心肌损伤和心脏结构改变程度减轻，改善心功能不全。

讨 论

近年来，心血管疾病已成为威胁人类健康的重大疾病［1-2］。许多心血管疾病的最终结果是心力衰竭，这是一种心脏无法满足身体代谢需求的综合征，已经成为心血管疾病的主要死亡原因［1-2］。临床心衰患者血清中可检测出高滴度的AT1-AA［6-7］。本研究通过使用小动物超声仪检测大鼠心脏功能变化，小动物超声和HE 染色检测大鼠心脏结构的变化。左心室射血分数、短轴缩短率、左心室收缩末期内径及左心室收缩末期容积等指标是评价左心室整体功能的重要指标，即诊断心衰的重要指标［2］。实验结果显示AT1-AA 的长期存在可以使心功能下降及心脏结构改变。

心肌细胞损伤和死亡在心功能不全的发展过程中发挥重要作用。细胞凋亡作为细胞程序性死亡的方式之一，心肌细胞凋亡的持续存在可以增加心肌细胞死亡，导致心功能不全，抑制心肌细胞死亡可有效改善心功能［4-5］。我们实验室的前期研究发现在培养心肌细胞中给予AT1-AA 处理能够诱导心肌细胞凋亡［19］，本实验使用TUNEL 染色和Western blot 技术发现AT1-AA 长期存在可以引起心脏组织细胞凋亡增加，提示AT1-AA 可能参与心力衰竭进程，但在心功能不全中AT1-AA 诱导心肌细胞凋亡的具体机制尚不清楚。

Figure 4. The expression of autophagy-related proteins was changed in the heart tissues of AT1-AA positive rats，and both autophagy inhibi⁃tor 3-MA and AT1aR knockout changed the expression of autophagy-related proteins in heart tissues induced by AT1-AA. Mean±SEM.n=6. *P＜0.05 vs vehicle group；#P＜0.05 vs AT1-AA group.图4 AT1-AA 阳性大鼠心脏组织自噬相关蛋白表达变化，自噬抑制剂3-MA 和AT1aR 敲除均可改变AT1-AA 诱导的心脏组织自噬相关蛋白的水平

自噬是溶酶体降解并清除受损细胞器的过程。通过平衡细胞合成和分解，自噬可以稳定细胞内环境［8］。然而，过多的和不受控制的自噬可致细胞的程序性死亡［10-11］。自噬的程度可用LC3-Ⅱ/LC3-I 比值评价，随着自噬增加，LC3-Ⅱ表达逐渐增多［10］。P62受体是自噬的底物结合物，在自噬溶酶体降解过程中，P62 受体被降解清除，而当自噬受阻，P62 蛋白的表达则显著增加［3］。Beclin1 作为哺乳动物同系物，有促进自噬活性的作用［10］。本研究通过用Western blot 法检测自噬相关蛋白，发现AT1-AA 可以激活自噬；为了进一步探讨自噬对AT1-AA诱导心脏组织细胞凋亡的影响，我们给大鼠腹腔注射自噬抑制剂3-MA，发现自噬参与AT1-AA 诱导心功能不全中心肌细胞凋亡的过程。

研究表明，AT1-AA 可以通过专一识别、结合AT1R 来发挥类血管紧张素Ⅱ的激动样作用［18］。因此为了进一步探讨AT1aR 在AT1-AA 阳性大鼠心功能不全进程中的作用及意义，我们使用AT1aR敲除大鼠，主动免疫构建AT1-AA 阳性大鼠模型，观察AT1aR敲除对AT1-AA 阳性大鼠心肌细胞损伤、心脏结构改变及心功能的影响，同时检测心肌细胞凋亡和自噬水平的变化。结果提示敲除AT1aR可以抑制AT1-AA 诱导的大鼠心脏组织自噬和凋亡水平，减弱AT1-AA 诱导的大鼠心肌损伤、心脏结构改变，改善心功能不全。本结果证明AT1-AA 确是作为受体激动剂，需要与AT1R 结合，才能发挥其诱导自噬和凋亡，导致大鼠心肌损伤的作用。

综上所述，AT1-AA 可以作用于AT1aR，上调大鼠心脏组织自噬，诱导在体大鼠心肌细胞凋亡，进而引起心功能不全，参与心力衰竭的进程。本研究结果可为临床治疗心力衰竭特别是AT1-AA 阳性心力衰竭提供理论依据和治疗的潜在靶点。