黑木耳高温胁迫条件优化研究*

马银鹏，孔祥辉，韩增华，马庆芳，戴肖东，刘佳宁，张介驰，张丕奇

（黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]富含蛋白质、粗纤维、维生素等营养物质，含有的多糖、黑色素、腺苷等活性物质具有抗氧化、降血脂、降血糖等功效，是一种珍贵的食（药）用菌[2]。目前，黑木耳栽培以露地栽培模式为主[3]，环境的可控性较差，整个生长发育期间时常受到各种生物和非生物的胁迫[4]。在非生物胁迫中，温度是对食用菌生长发育影响最活跃、最重要的因素[5]。

高温是导致食用菌产量降低和品质下降的重要非生物胁迫因子之一，生物体对高温胁迫的耐受性是其赖以生存和正常发育的重要特性[6]。真菌菌丝的培养特征与环境条件密切相关，层孔菌属（Fomes sp.）菌株EUM1在40℃高温胁迫时，菌丝体分支率、菌丝长度和菌丝直径分别降低15%、32%和13%[7]。刘秀明等[8]研究了不同白灵侧耳（Pleurotus eryngii var.tuoliensis）菌株对高温胁迫的反应，结果发现4个白灵侧耳菌株高温胁迫后，恢复培养时菌落的生长速率、生长势和菌丝形态特征存在差异。不同种类食用菌不仅菌落形态不同，而且菌丝的微观形态也不完全相同[9]，在受到高温胁迫后，菌丝的微观形态对高温胁迫的应激反应也不相同。开展高温胁迫的生理研究时，需要稳定的试验条件和参数，以优化高温胁迫响应机制研究的试验条件。张美敬等[10]研究了糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）和白黄侧耳（P.cornucopiae）高温胁迫的条件，结果发现2种侧耳的高温胁迫温度为40℃，胁迫时间为48 h。目前对黑木耳高温胁迫条件的研究报道较少，仅李红等[11]比较了辽宁省主栽的9个黑木耳菌株的耐高温能力，发现“黑29”和”纯黑山”经42℃高温胁迫8 h后可恢复正常生长。

因此，通过对不同黑木耳菌株最适生长温度，高温胁迫温度和胁迫时间的测定，研究高温胁迫后黑木耳菌丝恢复生长的情况，以期获得黑木耳高温胁迫生理研究的试验条件和参数，以确定黑木耳高温胁迫的最适条件。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株

27株黑木耳菌株材料信息见表1，均保藏于黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心。

表1 供试材料Tab.1 Strains used in this study

1.1.2 培养基

PDA培养基，购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 最适生长温度

将黑木耳菌种继代培养后3次活化，使用菌龄7 d的菌种为材料，沿菌落边缘用打孔器打取直径1 cm的菌块，接种到PDA培养基中央（培养皿直径90 mm），培养基定量25 mL，菌丝面朝上。分设25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃共6个温度梯度，每个温度梯度设5个重复。分别于各温度条件下培养，菌丝生长量以菌落直径计量，以长速最快的菌株长满培养皿时终止培养，用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.2 高温胁迫处理条件

参考植物高温胁迫处理温度，即高温胁迫处理温度为最适温度提高10℃[10]，分设为最适生长温度提高10℃、提高12℃和提高14℃共3种高温胁迫处理方式。以最适生长温度培养7 d的各黑木耳菌株为试验材料，高温胁迫处理后于最适生长温度下恢复生长，以高温胁迫后菌丝恢复生长情况为指标，研究黑木耳菌株高温胁迫处理的最适条件。

1.2.3 高温胁迫后菌丝恢复生长情况

黑木耳菌株于最适生长温度条件下培养7 d，最适高温胁迫条件处理，最适生长温度恢复培养，观测计算菌丝恢复的生长速率。挑取恢复的黑木耳菌丝于显微镜下观察恢复后菌丝尖端的显微形态，测量菌丝尖端直径。黑木耳菌株恢复生长10 d后，观察菌丝色素产生情况。每个处理3个重复。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 16软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析方法进行显著性分析，不同小写字母表示差异达到显著水平 （P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 菌丝最适生长温度

不同温度条件下黑木耳菌株菌丝平均生长速率见图1。

图1 不同温度条件下黑木耳菌株菌丝平均生长速率Fig.1 Mycelial growth rate of Auricularia heimuer strains under different temperatures

由图1可知，随着培养温度提高，黑木耳菌株菌丝平均生长速率呈先升高后降低趋势，其中以30℃下黑木耳菌株菌丝平均生长速率最大，为（0.42±0.08）cm·d-1，25℃下黑木耳菌株菌丝平均生长速率最小，为 （0.36 ± 0.11）cm·d-1。

不同黑木耳菌株最适生长温度不完全相同，其中14株（51.9%）黑木耳菌株在30℃下菌丝生长速率最大，8株（29.6%）黑木耳菌株在33℃下菌丝生长速率最大。38℃下黑木耳菌株菌丝均未萌发生长，可能是由于38℃下培养基失水太快，菌丝萌发困难。

不同温度条件下各黑木耳菌株菌丝均洁白浓密，长势较好，其中28℃和30℃下菌丝长势最佳。随着培养温度的提高，黑木耳菌株气生菌丝呈增加趋势。

综合以上试验结果，选取黑木耳菌株的最适生长温度为30℃。

2.2 高温胁迫处理条件

高温胁迫处理结果发现，40℃和42℃分别处理2 h、4 h和6 h，30℃时所有黑木耳菌株均可恢复生长。44℃处理2 h，30℃时所有黑木耳菌株均可恢复生长，但不同黑木耳菌株菌丝恢复生长速率不同。44℃处理4 h，30℃时8株（29.6%）黑木耳菌株恢复生长。44℃处理6 h，30℃时2株（7.4%）黑木耳菌株恢复生长，2株（7.4%）黑木耳菌株恢复生长较慢。随着胁迫温度的升高，培养基内水分损失较严重，影响黑木耳菌丝恢复生长。综合考虑，黑木耳菌株菌丝最适高温胁迫条件为44℃处理2 h。

2.3 高温胁迫后菌丝恢复生长情况

黑木耳菌株最适高温胁迫条件下菌丝恢复生长情况见表2。

表2 黑木耳菌株高温胁迫后菌丝恢复生长情况Tab.2 Recovery of mycelical growth of Auricularia heimuer strains under heat stress

由表2可知，44℃高温胁迫处理2 h，置于30℃培养4 d，所有黑木耳菌株菌丝均恢复生长，但是菌丝恢复生长速率不同，不同黑木耳菌株菌丝恢复生长速率差异显著（P＜0.05）。农06（编号15）菌丝恢复生长速率，最大为 （0.40 ± 0.17）cm·d-1，黑莲（编号 22）菌丝恢复生长速率，最慢为 （0.09±0.12）cm·d-1。

不同黑木耳菌株高温胁迫处理后，菌丝恢复生长长势、菌丝尖端变化、菌丝尖端直径、色素产生情况不同。11株（40.7%）黑木耳菌株菌丝恢复后长势较好，菌丝洁白、浓密，而其他黑木耳菌株菌丝恢复后长势一般，菌丝较洁白、稀疏。15株（55.6%）黑木耳菌株高温胁迫后在胁迫处形成凸起，凸起处气生菌丝较多，恢复生长后新生长的菌丝与未高温胁迫处理菌丝基本一致。各黑木耳菌株菌丝尖端直径为 0.77 μm～1.15 μm，其中特产 2 号菌丝尖端直径最大为 （1.15± 0.01）μm；兴安 4 号菌丝尖端直径最小为 （0.77±0.03）μm。11 株 （40.7%）黑木耳菌株高温胁迫后产生色素，其他黑木耳菌株高温胁迫后产生少量色素或不产生色素。

3 讨论与结论

生物体对环境胁迫的应答一直是生物学的基本问题。环境条件（温度、湿度、pH、渗透压、氧分压等）的改变均会对生物体造成压力或胁迫。温度是影响生物体生理过程的重要生态因子之一，而食用菌在生长发育过程中，遇到高温胁迫时，会造成菌丝生长停滞、污染甚至死亡。决超[12]研究发现高温对糙皮侧耳生长发育4个典型阶段的生理生化特征造成影响，如对菌丝丙二醛（MDA）含量、可溶性物质变化、胞外酶、抗氧化酶活性和酯酶同工酶有影响。仇志恒[13]研究发现高温胁迫后的糙皮侧耳菌丝抵御棘孢木霉（Trichoderma asperellum）侵染的能力下降。因此，高温影响食用菌的生理过程，已成为限制食用菌生产的主要环境因子。不同种类食用菌对高温胁迫响应不同，最适高温胁迫处理条件存在差异。张美敬等[10]优化了糙皮侧耳和白黄侧耳高温胁迫条件，胁迫研究条件为马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养菌丝3 d，最适高温胁迫温度为40℃（最适温度加12℃），高温胁迫处理48 h。

本研究发现黑木耳菌丝最适胁迫温度为44℃处理2 h；黑木耳高温胁迫温度为最适合温度加14℃，可能是由于黑木耳菌丝对高温的耐受性较强，与李红等[11]的研究结果相似，44℃高温胁迫处理6 h后仍有4株黑木耳菌株能恢复生长。说明黑木耳菌丝较能耐高温，但对高温胁迫时间耐受性较差，可能是由于长时间的高温胁迫导致培养基失水过多，黑木耳菌丝无法继续生长。

高温胁迫下，氧化应激增强会引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）氧化生物膜，而形成脂质过氧化产物等[14]。硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances， TBARS）包 含 了大部分氧化伤害产生的醛酮类物质，因此作为衡量脂质过氧化的重要生理指标[15]。另外，高温胁迫下菌丝保护酶活性的变化也可作为一种评价指标。郭敬等[16]研究发现高温胁迫对白玉菇（Hypsizygus marmoreus）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、真姬菇（Hypsizygus marmoreus）菌丝胞内酶和菌丝保护酶均有不同程度影响。此次研究仅通过高温胁迫后菌丝恢复生长情况初步确定了黑木耳最适高温胁迫条件，结果有待通过菌丝保护酶活性等方面的研究进一步优化。