熟地黄提取物对糖尿病肾病大鼠AKT/GSK-3β信号通路及足细胞上皮间质转化的影响

管陈安 叶华茂 徐光标 王莎莎 蒋钻红

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）属糖尿病并发症之一，也是造成国人终末期肾病第2位的原因；机体持续的高糖状态是DN形成的主要原因[1]。高糖环境下足细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），即肾小球脏层上皮细胞表型转化；足细胞EMT是DN尿蛋白形成和肾脏纤维化形成的重要机制之一[2]。熟地黄具有滋阴补血、益精填髓功效。熟地黄提取物（rehmannia glutinosa extract，RGE）作为熟地黄主要成分，表现出明显护肝活性，但其药理学机制尚不清楚[3]，其是否对DN有影响也尚未明确。在糖尿病并发症中，蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称 AKT）/糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）信号通路与DN、糖尿病心肌病等关系密切[4]。基于此，本研究采用高糖高脂、链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导建立DN大鼠模型，探讨RGE对DN大鼠EMT的影响及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠（SPF级），体重（200±10）g，8～10周龄，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK（京）2018-0013；动物使用许可证号：SYXK（京）2018-0051；动物质量合格证号：WTLH2020041517]。所有大鼠均在温度（24±0.5）℃、湿度（55±5）%、光照/黑暗（12/12）h环境中常规饲养。

1.1.2 主要药物、试剂与仪器 熟地黄（西安嘉博盈生物科技有限公司，批号：121196，纯度：96%，经鉴定符合2015年版《中华人民共和国药典》相关规定[5]）；高糖高脂饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，批号：TP-2002，各组分比例：基础饲料61.9%、蔗糖20%、猪油10%、蛋黄粉8%、胆酸钠0.1%）；STZ（美国sigma公司，批号：S0131）；盐酸贝那普利片（北京诺华制药有限公司，10 mg/片，批号：20191013）；尿蛋白定量测试盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：SNM297）；HE试剂盒（上海生工生物技术公司，批号：E607318）；糖原染色（periodic acid-schiff stain，PAS）、马森三色染色（Masson's trichrome stain，MASSON）试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，批号分别为：G1280、G1340）；RNA 提取试剂盒、cDNA 第一条链合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、蛋白裂解液（北京启维益成科技有限公司，批号分别为：114162-64、25011、R121-1、L1667）；磷酸化 AKT（p-AKT）、AKT、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、GSK-3β、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、羊抗鼠二抗（英国abcam公司，批号分别为 ：ab8805、ab151279、ab145937、ab93926、ab9485、ab1003）。血糖仪（德国罗氏集团，型号：Accu-Chek Active）；分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司，型号：UNICOWFJ2）；显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司，型号：XPF-500C）；实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪（美国ABI公司，型号：7500）；全自动凝胶成像分析系统（上海天根科技有限公司，型号：Tanon 4800）。

1.2 方法

1.2.1 RGE的制备 熟地黄依次经过石油醚、乙醚去脂溶性杂质，80%乙醇脱单糖、低聚糖，1 kg加10 L水，在90～100℃水中提取3次，3 h/次，提取液合并并过滤，70℃水浴减压浓缩，加入5倍95%乙醇沉淀过夜；沉淀物经无水乙醇、丙酮、乙醚沉淀，经65℃真空干燥得地黄多糖，纯度鉴定为良好，放置备用。

1.2.2 动物分组及给药处理 实验前所有大鼠检测尿蛋白、血糖水平，没有出现异常。参照文献[6]构建DN大鼠模型，高糖高脂饲料饲养大鼠4周，4周后禁食12 h腹腔注射40 mg/kg STZ，72 h后尾静脉采血检测血糖水平，空腹血糖≥16.70 mmol/L即为造模成功。建模成功60只，随机分为模型组、RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组，每组12只；另择12只大鼠作为对照组，对照组基础饲料饲养4周，4周后禁食12 h腹腔注射等体积0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液。RGE（低、中、高）剂量组（1、2、4）g/kg RGE灌胃[7]，阳性对照组 4 mg/kg贝那普利灌胃[8]，对照组、模型组0.9%氯化钠溶液灌胃，灌胃液体体积均为10 ml/kg，1次/d，连续6周。

1.2.3 一般情况观察 实验结束后观察大鼠一般情况，包括大鼠毛色情况、精神状态、饮食状态、大小便情况等。

1.2.4 血糖、尿蛋白、肾功能指标检测 收集大鼠24 h尿液，尾静脉采血，立即处死大鼠，部分肾脏置于4%多聚甲醛中固定，部分置于-80℃冰箱保存待检。采用血糖仪检测血糖水平，采用尿蛋白定量测试盒定量分析24 h尿蛋白，分光光度计检测尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平。

1.2.5 肾脏组织形态观察 4%多聚甲醛中固定的肾脏组织经乙醇脱水、石蜡包埋后切片，切片厚度6 μm，每组取部分切片，经HE、PAS、MASSON染色后显微镜下观察肾脏组织形态。

1.2.6 肾脏组织 E-钙黏素（E-cadherin，E-Cad）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）mRNA表达检测 采用qRTPCR法。-80℃冰箱中取部分肾脏组织，RNA提取试剂盒提取总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA，引物序列如下，E-Cad（289bp）F：5'-TTCAAGGTCAGCCTGGTATA-3'、R：5'-AAAGGGCACGCTATCAACAT-3'；α-SMA（403bp）F：5'-ACTGGTATTGTGCTGGACTC-3'、R：5'-TGATGCTGTTATAGGTGGTT-3'；FN（375bp）F：5'-CAACCAGCAGAGTCCCAAAG-3'、R：5'-TCCCAGGAGACGGTAAGCAC-3'；GAPDH（196bp） F：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3'、R：5'-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'。20 μl反应体系：10 μl 2×SYBR qPCR Mix、1 μl cDNA （50 ng/μl）、0.5 μl/0.5 μl F/R（10 μmol/L）、8 μl ddH2O；反应条件包括 94 ℃、60 s；95 ℃、30 s，（56.9 ℃、30 s，57.4 ℃、40 s，56.5 ℃、40 s，58.0 ℃、30 s），40个循环。引物由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。2-ΔΔCt法计算 E-Cad、α-SMA、FN mRNA 相对表达水平。

1.2.7 肾脏组织 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β 蛋白表达检测 采用Western blot法。部分肾脏组织添加蛋白裂解液冰上研磨，13 400 r/min（离心半径10 cm）4℃离心20 min后收集上清液，即为总蛋白。凝胶电泳分离蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分 别 加 入 一 抗 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、GAPDH，4℃孵育过夜；加入对应二抗，室温孵育1 h。全自动凝胶成像分析系统对结果拍照并用自带软件进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量数据以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠一般情况比较 对照组大鼠毛色发亮、精神活跃，饮食、大小便均正常；模型组大鼠毛色灰暗、精神萎靡，尿液量明显增多且发臭；RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组毛色较模型组有明显缓和、精神状态缓解，尿液量相对减少。

2.2 6组大鼠血糖、尿蛋白、肾功能指标比较 与对照组相比，模型组大鼠血糖、24 h尿蛋白、尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平均升高（均P＜0.05）；与模型组相比，RGE低剂量组大鼠血糖、24 h尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮水平均降低（均 P＜0.05），RGE（中、高）剂量组、阳性对照组大鼠血糖、24 h尿蛋白、尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平均降低（均P＜0.05）。见表1。

表1 6组大鼠血糖、尿蛋白、肾功能指标比较

2.3 6组大鼠肾脏组织形态比较 对照组大鼠肾小管、肾小球排列正常、细胞分布均匀；模型组肾脏组织肾小管空泡变性，肾小球系膜基质扩张，肾小球硬化和胶原沉积现象明显；RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组病理变化明显减轻。见图1（插页）。

图1 6组大鼠肾脏组织病理学图片（REG为熟地黄提取物；PAS为糖原染色；MASSON为马森三色染色；×400）

2.4 6组大鼠肾脏组织E-Cad、α-SMA、FN mRNA表达水平比较 与对照组相比，模型组大鼠肾脏组织E-CadmRNA 表达水平降低（P＜0.05），α-SMA、FN mRNA 表达水平均升高（均P＜0.05）；与模型组相比，RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组肾脏组织α-SMA、FN mRNA 表达水平降低（均 P＜0.05），RGE（中、高）剂量组、阳性对照组肾脏组织E-Cad mRNA水平均升高（均P＜0.05）。见表2。

表2 6组肾脏组织中E-Cad、α-SMA、FN mRNA水平比较

2.5 6 组大鼠肾脏组织 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表达水平比较 6组大鼠肾脏组织AKT、GSK-3β蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与对照组相比，模型组大鼠肾脏组织p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白表达水平升高（均 P＜0.05）；与模型组相比，RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组肾脏组织p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平均降低（均 P＜0.05）。见图2、表3。

图2 6 组大鼠肾脏组织 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β 蛋白表达电泳图比较[p-AKT为磷酸化AKT；AKT为蛋白激酶B；p-GSK-3β为磷酸化GSK-3β；GSK-3β为糖原合成酶激酶-3β；GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；A为对照组，B为模型组，C为熟地黄提取物（RGE）低剂量组，D为RGE中剂量组，E为RGE高剂量组，F为阳性对照组]

表3 6组大鼠肾脏组织p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表达水平比较

3 讨论

祖国医学将糖尿病称为消渴病，DN属其并发症，中医上并无DN的独立记载，但却发现消渴日久可出现水肿，巢元方《诸病源候论》：“消渴其久病变，或发痈疽，或成水疾”。宋·赵佶《圣济总录》提出“消肾”之病名，云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，能为水肿”[9]。上述描述与DN症状类似，DN的基本症候的治疗原则为内热燔灼、消蚀气阴，可苦寒坚阴、清热益气；经络荣卫气伤、内有干血，当化瘀通络。本研究发现，与对照组相比，模型组大鼠毛色灰暗、精神萎靡，尿液量明显增多且发臭，肾脏组织发现肾小管空泡变性，肾小球系膜基质扩张，肾小球硬化和胶原沉积现象明显，提示DN大鼠出现明显肾脏组织病理损伤，导致肾小球、肾小管功能障碍，进而肾小球重吸收功能发生障碍，影响疾病。与模型组相比，RGE（低、中、高）剂量组出现明显的症状缓解情况，《本经逢原》有云：“熟地黄，假火力蒸晒，转苦为甘，为阴中之阳，故能补肾中元气”[10]。RGE作为熟地黄主要活性成分在其中发挥作用，且在DN中不同剂量RGE均表现出对疾病的缓解作用。研究还显示，与对照组相比，模型组血糖、24 h尿蛋白、尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平升高，提示模型组大鼠肾功能损伤严重；而与模型组相比，RGE（低、中、高）剂量组及阳性对照组上述水平均有所降低，表明RGE及阳性药物组均可明显缓解大鼠肾功能损伤，具有保护肾功能作用。

肾纤维化过程中表现为细胞外基质过度合成、重塑、沉淀，中心环节涉及EMT过程，病理状态下可观察到上皮细胞表现出纤维化现象[11]。在EMT中上皮标志物E-Cad表达缺失，间质标志物α-SMA、FN过表达为主要特征[12]，其中E-Cad存在于正常上皮细胞连接处，是细胞与细胞间连接的关键黏附分子，缺失E-Cad会导致与之结合的核内堆积蛋白游离出来，进而激活一系列间质基因转录[13]，如间质基因α-SMA的表达和肌动蛋白重组过程，进而导致间质升高；FN作为目前公认的基质成分之一，其水平反映基质情况[14-15]。大量成纤维细胞在肾小管处通过EMT过程分泌细胞外基质，进而促进肾脏纤维化过程[16]。本研究发现，与对照组相比，模型组肾脏组织中E-Cad mRNA表达水平降低，α-SMA、FN mRNA表达水平升高，提示DN肾脏组织中关键黏附分子E-Cad使与其结合的核内堆积蛋白游离出来，进而激活间质基因α-SMA的表达，从而促进FN分泌，增加基质水平，可能促进纤维化水平，加重疾病。与模型组相比，RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组肾脏组织中α-SMA、FN mRNA 水平降低，RGE（中、高）剂量组、阳性对照组肾脏组织中E-Cad mRNA水平升高，提示RGE恢复缓解E-Cad水平，使其作用正常，减少α-SMA、FN的表达，从而缓解足细胞EMT过程，缓解疾病。

AKT作为PI3K/AKT信号通路重要转导途径，可参与细胞凋亡、蛋白质合成、葡萄糖运输、血管生成等其他重要的生理功能调节[17]，在EMT中诱发肾小管上皮细胞发生改变[18]，GSK-3β是AKT的下游基因，参与AKT信号通路EMT过程，静息状态下呈去磷酸化状态，受到刺激后通过影响Snail基因等下游底物发挥作用[19-20]，且进一步研究发现p-GSK-3β与E-Cad存在明显相关性[21]。本研究发现，与对照组相比，模型组肾脏组织中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白水平升高，提示在DN中刺激AKT磷酸化从而激活下游GSK-3β表达，且与E-Cad关系密切，可能影响E-Cad发挥作用。与模型组相比，RGE（低、中、高）剂量组、阳性对照组肾脏组织中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平降低，提示RGE干扰DN后AKT激活状态被抑制，从而缓解对GSK-3β的影响，进而恢复E-Cad水平，减少α-SMA、FN的表达，缓解EMT过程，缓解DN纤维化过程。

综上所述，RGE可抑制AKT/GSK-3β信号通路活化以及缓解足细胞EMT过程，从而实现对DN大鼠的保护。但RGE成分复杂，亦可能通过其他途径发挥作用，亦可能RGE影响AKT上游基因发挥作用，需要进一步研究。