113例静脉血栓栓塞症患者遗传性抗凝蛋白缺陷分析

徐琦煜 金艳慧 杨丽红 李小龙 刘斯奇 王明山

易栓症是指由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等的遗传性分子缺陷或因存在获得性血栓形成危险因素而易发生血栓栓塞的一类疾病。一般常指典型的静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE），其中深静脉血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）和肺栓塞（pulmonary thromboembolism，PTE）最为常见，还包括一些非典型的静脉血栓形成（内脏、肝、上肢、颅内静脉血栓形成）。VTE属于多基因-环境因素共同作用的疾病，是一种常见的心、肺血管疾病和死亡原因。随着对易栓症研究不断深入，临床发现获得性和遗传性易栓症对于VTE的发生和发展有着重要的影响。3种生理性抗凝蛋白：蛋白 C（protein C，PC）、蛋白 S（protein S，PS）、抗凝血酶（antithrombin，AT）缺陷是最常见的遗传性易感因素[1]。目前，我国对易栓症的研究报道多见于血栓性疾病的家系报道，群体性研究较少。本研究对近几年生活在浙江省温州地区无明显诱因VTE患者的抗凝蛋白进行了表型检测和基因筛查，并分析患者临床表现特点，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019年6月至2020年4月在温州医科大学附属第一医院血管外科门诊及住院接受治疗的VTE患者113例，其中男64例，女49例；年龄19～86（53.4±17.1）岁；DVT 72例，PTE 25例，DVT合并PTE 3例，颅内静脉窦血栓形成13例。患者均经彩色多普勒超声、CT肺动脉造影或数字减影血管造影明确VTE诊断。排除具有明显诱因如抗磷脂抗体综合征、骨髓增殖性疾病、肝肾病史、肿瘤、妊娠、口服避孕药、手术、长期卧床等患者，且在未经溶栓和抗凝治疗前或者至少停药2周后抽血检测。根据本院检验实验室参考范围，将AT活性＜75%、PC活性＜70%、PS活性＜60%判断为抗凝蛋白缺陷。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者采血样前均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 用蓝色真空抗凝采血管采集患者外周静脉血2.7 ml各2份（0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝）。一份3 000 r/min离心10 min，上层贫血小板血浆用于凝血指标检测，并于2 h内完成；另一份用于DNA提取及PCR扩增测序。

1.2.2 血浆抗凝蛋白表型检测 在Stago STA-R Max全自动血凝仪（法国Stago公司）上用发色底物法检测AT活性、血浆PC活性，凝固法检测PS活性。在酶标仪（上海博蕴生物科技有限公司）上用ELISA法检测AT抗原含量（用于AT缺陷症分型）。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 抗凝蛋白基因突变检测 采用PCR扩增及DNA测序法。用基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取患者外周血基因组DNA。在ABI The rmal cycler 2720（美国）扩增仪上扩增 AT、PC、PS基因相应的外显子及侧翼序列，用Chromas软件将测序结果与美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）基因文库的基因序列进行比对，寻找基因突变位点。

2 结果

2.1 血浆抗凝蛋白表型检测结果 113例VTE患者中共检出抗凝蛋白缺陷者33例（29.20%），其中以PS缺陷最多，为16例（14.16%），其次为PC缺陷和复合缺陷各7例（6.19%），AT缺陷3例（2.65%）。复合缺陷中PC+PS缺陷 3例（2.65%），PC+AT缺陷和PS+AT缺陷均为2例（1.77%），见表1。所有7例AT缺陷患者中AT抗原含量降低5例，2例正常。

表1 113例VTE患者抗凝蛋白缺陷发生情况

2.2 抗凝蛋白基因突变检测结果 对33例抗凝蛋白缺陷患者进行基因扩增和测序，发现PS基因突变9例；PC基因突变12例，其中c.1318C＞T和c.833T＞C为新发现的突变；AT基因突变7例，其中c.1346T＞A和c.851T＞C为新发现的突变。见表2。

表2 抗凝蛋白基因突变信息

2.3 抗凝蛋白缺陷患者的疾病分布 33例抗凝蛋白缺陷患者以DVT为主，共20例（60.61%），其次为颅内静脉窦血栓形成和PTE，分别为7例（21.21%）和6例（18.18%）。见表3。

表3 抗凝蛋白缺陷患者的疾病分布[例（%）]

3 讨论

血液中的PC经凝血酶-血栓调节蛋白复合物激活后，成为活化蛋白 C（activated protein C，APC），当 PC 与内皮细胞PC受体结合时，其被激活，效应可增强20倍[2]；而PS作为APC的辅因子，可增强其对活化凝血因子Ⅴ和活化凝血因子Ⅷ的灭活[3]；AT是血浆中重要的抗凝物质之一，作为凝血酶和活化凝血因子Ⅹ的天然抑制物，可抑制血栓形成[4]；因此，PC、PS、AT在抗凝过程中起到非常重要的作用，其缺乏可使机体内促凝系统与抗凝系统失衡，机体处于高凝状态，可增加血栓形成的风险，是VTE重要的遗传性危险因素[5]。血栓不仅危害人类健康，甚至对人类生命构成严重威胁，只有早期掌握静脉血栓的遗传高危因素诊断并指导合理治疗才能降低其致残及致死率。

国内外研究对PC、PS和AT 3种抗凝蛋白缺陷研究较多。西方VTE患者中抗凝蛋白缺乏的检出率较低，而亚洲人群检出率明显增高[6]。Pabinger等[7]报道了680例VTE患者中发现PC、PS、AT缺陷率分别为 2.5%、1.3%、2.8%。与AT及PC缺陷相比，亚洲人群VTE患者PS缺陷更为显著，PS缺陷常合并PC、AT缺陷，称为联合缺陷，联合缺陷使VTE的风险明显增加。有报道无诱因VTE患者3种抗凝蛋白缺陷总发生率为22.6%～64.7%，均以PS缺陷发生率最高，复合缺陷发生率为0.9%～21.2%[8-9]。有研究发现VTE患者3种抗凝蛋白缺陷总发生率为26.4%，PS缺陷发生率最高为14.9%，复合缺陷发生率3.4%[10]。本研究显示，在浙江省温州地区无明显诱因113例VTE患者中，3种抗凝蛋白缺陷总的发生为33例（29.20%），其中以PS缺陷最多，为16例（14.16%），PC缺陷 7例（6.19%），AT缺陷 3例（2.65%），复合缺陷7例（6.19%），与上述研究报道的VTE患者缺陷发生率结果接近，但具体到每种单独缺陷和复合缺陷的发生率有所不同。由此可见，遗传性PC、PS和AT缺陷的人群分布特点具有地域及种族差异，也是温州地区VTE患者重要的遗传性危险因素，但不除外本研究中样本量小导致的数据偏倚，需扩大样本量研究进一步明确。

依据血浆抗凝蛋白表型检测结果，遗传性AT缺陷症可被分为抗原和活性同步降低的Ⅰ型，以及抗原正常而活性降低的Ⅱ型。有文献报道，在所有AT缺陷症患者中，表现为Ⅰ型缺陷症的仅占12%，而在出现血栓症状的患者中，Ⅰ型却达到80%，比例大大增加[11]。本研究发现的7例AT缺陷中5例为Ⅰ型，占5/7（71.42%）；2例为Ⅱ型，占2/7（28.58%）。从而提示温州地区VTE患者中AT缺陷主要表现为Ⅰ型AT缺陷。

实现易栓症的危险因素评估和明确根本病因需依赖于基因检测，其不受患者生理病理状态及药物的影响，可较为全面、准确地筛查易栓症的分子病因。遗传性抗凝蛋白缺陷症的基因突变形式包括重组突变、点突变、插入/缺失等，除少数病例外，大多是杂合子缺陷。在中国，c.565C＞T是最常见的PC基因突变，有大约0.9%发生率，是一个显著的静脉血栓形成的危险因素，其增加了8.8倍静脉血栓形成的风险[12]，在温州地区人群中也较为常见。PC基因突变中c.1318C＞T和c.833T＞C突变以及AT基因突变中c.1346T＞A和c.851T＞C为新发现的突变，丰富了突变数据库。使用PCR测序的突变筛查方法，本研究在21例先证者(包括5例复合缺陷)中发现了9例具有PS基因突变，这一比例（42.8%）与白种人群的PS突变发现率相似[13]，但测序不能发现大片段的插入和缺失突变。有研究认为大片段的PS基因异常是测序未发现突变者PS缺乏症的常见原因，需使用多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）来分析。因此，PS 基因测序突变分析未发现异常者，还应进一步行MLPA分析[14]，以明确诊断。

抗凝蛋白缺陷症导致的VTE国内外报道多以DVT和PTE为主[15]。本研究显示，VTE患者中以DVT为主，PTE和颅内静脉窦血栓形成例数类似。本研究中7例颅内静脉窦血栓形成均为PS缺陷，颅内静脉窦血栓形成是一种罕见的脑血管病，约占全部脑血栓形成的3.5%[16]，主要影响年轻人及儿童。导致颅内静脉窦血栓形成的危险因素有很多，而涉及到PS缺陷症导致颅内静脉窦血栓形成方面，并没有可靠的流行病学研究[17]。本研究患者均在充分鉴别及排除了其他常见的可能致颅内静脉窦血栓的疾病后，根据PS活性明显降低，考虑PS缺陷症致颅内静脉窦血栓形成，说明PS缺陷可能是无明显诱因颅内静脉窦血栓形成的一个重要遗传影响因素。

综上所述，温州地区VTE患者中遗传性抗凝蛋白缺陷率较高，可能是温州地区VTE患者常见的遗传性危险因素，其中以PS缺陷最为显著。本研究发现的PC基因突变中c.1318C＞T和c.833T＞C突变以及AT基因突变中c.1346T＞A和c.851T＞C为新发现的突变，为温州地区易栓症患者的基因突变积累资料。因此，对于高危易栓症人群进行抗凝蛋白及基因突变的检测，对明确血栓形成的原因、治疗方案的选择及疗程、预后具有重要的临床指导意义。