MMR、p53及 PD-L1在子宫内膜癌中的表达及临床意义

张闻雯 邓再兴 陈莉萍 赖世平 沈源明

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，患者呈年轻化趋势[1-2]。手术结合术后辅助治疗是EC最常见的治疗方法。2013年美国癌症基因组计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）提出EC分子分型计划，将EC划分为4类不同亚型：DNA聚合酶ε（DNA polymerase espilon，POLE）突变型、微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）型、低拷贝数（copy number abnormalities low，CNL）型和高拷贝数（copy number abnormalities high，CNH）型[3]。研究证实，TCGA分型比传统的病理形态学分型能更准确地指导EC患者术后治疗及预测预后。不同分子特征可能导致辅助放化疗敏感性差异，根据TCGA分型特征给予个体化精准辅助治疗是未来EC治疗的发展趋势。近年来，肿瘤免疫治疗的快速发展打破了肿瘤的常规治疗模式，尤其是免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的应用[4]。程序性死亡蛋白1（programmed death protein-1，PD-1）/程序性死亡蛋白配体 1（programmed death protein-ligand 1，PD-L1） 在肿瘤组织及肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）中的表达是筛选免疫治疗潜在获益人群的一项指标。研究表明在POLE突变型、MSI型的EC中PD-1/PD-L多高表达，多对免疫检查点抑制剂敏感,然而TCGA分型检查过程繁琐且价格昂贵，难以临床推广[5]。有学者提出一些简化方法试图替代TCGA分子分型，如根据免疫组化检测错位修复（mismatch repair，MMR）蛋白及抑癌基因p53表达情况将EC分为MMR缺失型/MMR完整型和p53突变型/p53野生型[6-8]。但对于这种简化分型与传统病理分型的相关性，以及其是否可辅助用于免疫检查点抑制剂适用人群的筛选尚不清楚。本实验通过免疫组化方法检测MMR蛋白、p53及PD-L1在EC中的表达情况，并分析简化的MMR/p53分子分型与EC的临床病理特征以及PD-L1表达的相关性，以期为免疫检查点抑制剂在EC中的应用提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年1月至2018年12月在湖州市妇幼保健院行子宫切除术的EC患者78例。所有患者均为初次治疗、术前未接受过内分泌治疗且无其它肿瘤病史；术后常规病理切片均经2位病理科医师重新评估。患者年龄28～90岁，平均56.9岁，其中≤50岁22例，＞50岁56例。临床分期采用2009年国际妇产科联盟（FIGO）标准分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别 59 例、8例、5例、6例。病理组织类型为子宫内膜样癌61例，非子宫内膜样癌 17例，包括浆液性癌10例，混合性癌2例，去分化癌2例，肉瘤、透明细胞癌、神经内分泌癌各1例；黏膜内癌15例，肌层浸润≤1/2者43例，肌层浸润＞1/2者20例；脉管阳性22例，阴性 56例；57例行淋巴结切除，其中阳性9例，阴性48例。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法 患者均采用免疫组化EnVision二步法检测MMR蛋白、p53及PD-L1表达情况。MMR蛋白相关抗体包括鼠抗人MutL同源蛋白1（MutL homolog 1，MLH1）、MutS 同源蛋白 2（MutS homolog 2，MSH2）、MutS 同源蛋白 6（MutS homolog 6，MSH6）、减数分裂后分离蛋白 2（Postmeiotic segregation increased 2，PMS2）单克隆抗体及p53蛋白购自福建迈新公司，兔抗人PD-L1单克隆抗体（CAL10）购自美国Pathcom system公司。具体操作：石蜡切片62℃烤箱过夜，脱蜡和水化，使用 EDTA缓冲液高压修复，室温自然冷却。3% H2O2溶液常温避光孵育，PBS缓冲液冲洗后加一抗，室温孵育60 min。PBS缓冲液冲洗3遍，加Max VisionTM2/HRP，室温孵育后PBS缓冲液冲洗。DAB显色，显微镜下观察染色进展，染色成功后过水冲洗，苏木素复染，流水返蓝，乙醇脱水二甲苯透明，封片后镜检。

1.3 结果判读 由2位病理科医生进行双盲独立阅片。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 及 p53均定位于细胞核，内对照为正常淋巴细胞或间质细胞，4种MMR蛋白细胞核中均出现棕褐色着色即判定为MMR表达完整，如有一种及以上MMR蛋白未出现核着色则判定为MMR表达缺失。p53以细胞核中出现棕褐色颗粒为阳性表达。p53呈现弥漫阳性（＞70%）或完全阴性时，均判定为p53突变型，否则为p53野生型。PD-L1的阳性对照为扁桃体组织，定位于细胞膜，呈黄色或棕黄色染色。计数肿瘤细胞PD-L1阳性数，≥1%定义为阳性，＜1%为阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验，两两比较采用χ2分割法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR蛋白及p53在EC中的表达情况 MMR完整型60例，缺失型18例，缺失率为23.07%。其中单个蛋白PMS2缺失 9例，MSH6缺失2例，MSH2缺失1例，MLH1与PMS2共同缺失4例，MSH2与MSH6共同缺失2例。p53突变型21例，p53野生型57例，突变率为26.92%。

2.2 MMR蛋白及p53的表达与EC患者临床病理特征的关系 MMR缺失型表达率与EC患者年龄、肿瘤病理类型、FIGO分期、肌层浸润深度、脉管浸润情况和淋巴结转移均无关（均P＞0.05）。p53突变型表达率与EC患者年龄、肿瘤病理类型、FIGO分期、脉管浸润情况和淋巴结转移均有关（均P＜0.05），在＞50岁、非子宫内膜样癌、晚期内膜癌（Ⅲ+Ⅳ）、脉管阳性、淋巴结转移阳性患者中表达率升高，而与EC患者肿瘤肌层浸润深度无关（P ＞0.05），见表1。

2.3 EC中PD-L1表达与MMR蛋白及p53表达的关系分析 PD-L1在p53突变型患者中的阳性表达率高于野生型患者（P＜0.05），而在MMR缺失型/完整型患者中阳性表达率比较无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 PD-L1表达与MMR及p53蛋白的关系[例（%）]

根据MMR蛋白及p53表达情况将78例EC患者分成4组：MMR缺失型且p53突变型组2例，MMR缺失组且p53野生型组16例，MMR完整型且p53突变型组19例，MMR完整型且p53野生型组41例。PD-L1在这4组患者中的阳性表达率差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。其中PD-L1在MMR缺失型且p53突变型组表达率最高，达100%，在MMR完整型且p53突变型组和MMR缺失组且p53野生型组中表达率相近，分别为73.68%和62.50%；在MMR完整型且p53野生型组表达率最低，为31.71%。其中，PD-L1在MMR完整型且p53突变型组与MMR完整型且p53野生型组表达差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 PD-L1在不同MMR/p53分子分型EC中的表达情况比较[例（%）]

3 讨论

以往临床对EC的分类大多为基于病理组织形态学，但这种方法主观性强，可重复性差，对预后的评估及对临床指导术后价值有限，不能满足临床需求。TCGA提出的EC的新的分子分类更能反应肿瘤的预后，更好地指导临床，具有里程碑意义。但其推广困难，研究者们致力于改良TCGA实验方法，寻求简便实用的分子分类方法。

MMR蛋白是MMR基因编码的蛋白产物，在DNA复制过程中保证其高度保守性和遗传的稳定性。在EC的发病机制中，主要有4种MMR蛋白起关键作用，分别是 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，它们在人体内以MLH1与PMS2结合，MSH2与MSH6结合形成二聚体复合物发挥作用。MMR蛋白表达缺失导致 DNA碱基错配无法校正，引起具有微卫星短串联重复序列长度改变，导致MSI发生。免疫组化法和PCR法检测MSI是目前相对简便、快速、经济的方法，Stelloo等[9]应用2种方法对696例EC患者进行检测，结果发现两者具有高度一致性。本研究中，MMR缺失型为23.07%（18/78），略低于TCGA分子分型中MSI高突变组（30%），其中以PMS2单个蛋白缺失最多见（11.54%），MLH1与PMS2配对缺失次之（5.13%）。18例MMR缺失型中，14例为中-高级别子宫内膜样癌，1例为浆液性癌，1例为混合型癌（浆液性癌+透明细胞癌），仅2例为低级别子宫内膜样癌。MMR蛋白缺失与EC患者的预后关系存在争议，目前尚无统一定论。Pakish等[10]用免疫组化检测了156例EC患者的MMR蛋白后发现，患者年龄、临床分期、肿瘤组织学分类及病理学分级、肌层浸润情况均与MMR蛋白是否缺失无关，这与本实验结果一致。Nagle等[11]对澳大利亚728例EC患者生存分析结果显示，EC的危险因素与MMR状态无关。但国内晋薇等[12]认为MMR蛋白表达缺失提示患者不良预后。他们研究显示，MMR缺失型EC多为低分化、FIGO分期晚，伴有深肌层浸润、脉管浸润及淋巴结转移者。也有学者认为MMR缺失型EC更易有磷酸酶张力蛋白同源酶（phosphatase and tensin homology，PTEN）突变，不伴有 p53 突变，恶性程度低，不易发生淋巴结浸润和转移[13]。Black等[14]发现，MMR缺失型EC患者的无病生存率和特异性生存率均有明显改善。

MMR蛋白缺失型EC患者大多数是散发病例，仅有约3%患有遗传性非息肉病性结直肠癌（Lynch综合征）。Lynch综合征是由MMR基因突变导致的常染色体显性遗传病，患者有高发EC、结肠癌、卵巢癌、胃癌等风险，而50%的女性患者中常以EC作为前哨癌。因此，对MMR缺失型患者及亲属进一步进行基因检测及遗传学咨询意义重大。

p53突变发生在10%～20%的子宫内膜样癌和90%的浆液性癌[15]中，它是一种抑癌基因，能诱导细胞凋亡、抑制细胞生长、调节转录。p53突变会丧失正常抑制癌细胞的作用，甚至能够促进细胞恶性转化。以往的研究提示p53突变是预后不良的因素，如Talhouk等[7]用p53免疫组化代替拷贝数检测得到的p53突变型中，多为非子宫内膜样癌，且级别高、进展快、预后差。本研究结果也提示p53突变型中患者年龄大，多为疾病晚期，伴有淋巴结转移，脉管浸润，多为非子宫内膜样癌，该结果提示p53突变型可能是子宫内膜癌预后不良的重要因素之一。

当前以PD-1/PD-L1为靶点的免疫治疗已成为肿瘤强有力的新的治疗方法，PD-L1表达于多种肿瘤组织中，其与配体PD-1结合后，抑制CD4+T细胞的增殖和活化，同时使IL-2和INF-α分泌下调，抑制T细胞功能，从而形成肿瘤免疫抑制的微环境，使得肿瘤细胞逃避免疫系统监视。文献报道MMR缺失型EC具有较高的突变率，肿瘤周围具有丰富的淋巴细胞浸润，患者是PD-1/PD-L1免疫治疗的受益群体[3，16]。多个临床研究表明，MMR缺失型患者的PD-L1蛋白表达率明显升高，且经免疫治疗后，临床缓解率明显高于MMR完整型患者[17-19]。本研究显示，PD-L1在EC中表达率为50%，在MMR缺失型中略高，表达率为66.7%，在p53突变型中最高，达76.2%。在结合MMR及p53蛋白分组中，PD-L1在这4组的表达有差异，主要在MMR完整型且p53突变型组与MMR完整型且p53野生型组之间，说明PD-L1的表达与p53突变或野生相关，与MMR蛋白表达完整或缺失不相关。这与上述文献报道不符，可能与PD-L1克隆号不同有关，也可能与本研究样本量较小有关。

本研究中有2例患者同时出现MMR缺失和p53突变，患者年龄均56岁，1例为浆液性癌，FIGOⅢ期，1例为混合性癌（浆液性癌+透明细胞癌），FIGO为Ⅳ期，均伴有附件浸润和淋巴结转移。Leon-Castillo等[20]分析了64例同时发生MMR缺失和p53突变的EC的临床病理特征、分子表型及相关预后，他们认为这类EC的p53突变是肿瘤发展过程中的继发性事件，他们建议应将这类EC归入MMR缺失型EC。本研究中2例均为晚期患者，病程进展快，但PD-L1均阳性表达，提示PD-1/PD-L1免疫治疗可能使之收益。

综上所述，本研究结果显示，p53蛋白对EC的预后及分型具有重要意义，MMR蛋白检测为EC患者进行Lynch综合征分流提供依据。PD-L1在MMR缺失且p53突变组表达，提示免疫治疗可能使该分子亚型患者受益。EC是一组高度异质性肿瘤，其发生、发展具有多种分子通路，本研究为回顾性分析，样本量有限，对于EC的分子分型策略还需进一步深入的多中心临床研究以获得更多的实验证据。