VEGF-A和VEGF-C双拮抗抑制血管瘤内皮细胞增殖的实验研究

黄崇青 黄景勇 裘益辉

血管瘤是常见的肿瘤，好发于头面部[1]。大多数皮下血管瘤是良性的，但有些可能转化后变成恶性[2]。目前，血管瘤的增生和消退演变机制仍不完全清楚。研究发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A（VEGF-A）的表达在血管瘤的形成过程中起重要作用[3]。VEGF家族由6个成员组成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）[4]。笔者团队前期研究发现，血管瘤增生期VEGF-A和VEGF-C的表达水平明显高于血管瘤消退期；采用转染携带短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）质粒的方法抑制 VEGF-A或VEGF-C表达，可以抑制血管瘤内皮细胞（hemangioma endothelial cells，HemECs）的生长；但 VEGF-A 和VEGFC似乎通过不同的信号通路来调节HemSCs的增殖和凋亡[5]。笔者团队在前期研究的基础上，拟进一步探讨同时抑制VEGF-A和VEGF-C表达对HemECs增殖的影响及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HemECs（上海生命科学研究所）；原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（美国 ATCC公司）；CAG 启动子（promoter of cytomegalovirus early enhancer element-chicken betaactin gene promoter-rabbit beta-globin gene acceptor，pCAG）-荧光素酶（luciferase，LUC）骨架（美国 Clontech公司）；人胚胎肾细胞 293T（human embryonic kidney 293T，HEK293T）（美国 ATCC 公司）；Lipofectamine-3000（美国Invitrogen公司）；MTT细胞增殖检测试剂盒（美国 Roche公司）；溴脱氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）试剂盒（美国Millipore公司）；Western blot的初级抗体（美国Cell signaling公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的抗兔二抗（美国Jackson Immuno研究所）；外购的10周龄雄性裸鼠（上海实验动物中心），在每个实验条件下分析20只小鼠。

1.2 方法

1.2.1 实验模型建立和分组 将2×107个HemECs和1×107个 HUVEC 混合，沉淀，然后重悬于 200 μl基质胶（美国 Becton-Dickinson Biosciences公司）皮下注射到裸鼠的背部。通过生物发光测定IVIS成像系统（美国Xenogen公司）对肿瘤进行成像，4周后评估植入的肿瘤。在尾静脉注射50 mg/kg体重的荧光素（美国Sigma-Aldrich公司）5 min后拍摄图像，行肿瘤生物发光图像采集（60 s后可得分析结果，行10次图像分箱）。解剖裸鼠后测量植入肿瘤的重量。将实验裸鼠分为4组：空白对照组（control组）、通过shRNA技术抑制VEGF-A表达的shVEGF-A组、抑制VEGF-C表达的shVEGF-C组以及同时抑制VEGF-A和VEGF-C表达的shVEGFA+C组。

1.2.2 具体实验方案

1.2.2.1 质粒制作 （1）以前面获得的在消退期和增生期血管瘤中发生明显表达水平变化的VEGF家族成员为对象，设计shRNA。（2）HemECs进行细胞培养，用携带对照（control组）或shVEGF-A或shVEGF-C或组合的 shVEGF-A和 shVEGF-C（shVEGF-A+C）的质粒转染后，采用RT-qPCR法检测转染细胞上VEGF-A和VEGF-C mRNA的表达。（3）以确定抑制效率的携带特异shRNA的质粒制作腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），用以体内实验。使用pCAG-LUC骨架制备pCAG-shVEGF-A-LUC、pCAG-shVEGF-C-LUC 和pCAG-shVEGF-A+C-LUC，进行测序以验证这些新制备的质粒的正确方向。使用HEK293T细胞用Lipofectamine-3000产生携带目标构建体的AAV。shVEGF-A的序列是5'-TGTGAATGCAGACCAAAGA-3'。shVEGFC的序列是5'-TGCAAGCATTATGTCAGCA-3'。对照的序列是5'-GGTATCTACTAGATGTACT-3'。

1.2.2.2 抑制相应VEGF蛋白对HemECs生长和增殖的影响观察 （1）以设计的携带特异的shRNA的质粒转染HemECs，并使用MTT法检测细胞生长的变化。具体为使用MTT细胞增殖检测试剂盒（美国Roche公司）检测570 nm处的吸光度值。（2）以设计的携带特异shRNA的质粒转染HemECs，并在细胞培养中加入BrdU，通过染色定量的方法检测细胞增殖的变化。具体为将BrdU（美国 Sigma-Aldrich公司）加入到培养细胞中，终浓度为1 μg/ml；然后2 h后使用BrdU IHC试剂盒进行BrdU的免疫细胞化学染色，DNA用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美国 Thermo Scientific公司）染色。（3）以设计的携带特异shRNA的质粒转染HemECs，并提取细胞的蛋白，进行Western blot检测与细胞周期相关的因子变化以确定VEGF家族蛋白的下游的细胞周期相关信号传导通路。

1.2.2.3 抑制相应VEGF蛋白对HemECs凋亡的影响观察 （1）以设计的携带特异的shRNA质粒转染HemECs，并使用Annexin V方法，采用流式细胞分析技术测定细胞凋亡的变化。（2）以设计的携带特异shRNA的质粒转染HemECs，并提取细胞的蛋白，进行Western blot检测与细胞凋亡相关的因子变化以确定VEGF家族蛋白的下游的凋亡相关信号传导通路。

1.2.2.4 抑制相应VEGF蛋白对体内血管瘤生长的影响观察 将抑制相应VEGF蛋白的HemECs种植于裸鼠皮下，采用荧光素测定法（瘤细胞携带荧光素酶）测定其对体内血管瘤生长的影响，4周后解剖裸鼠后测量植入肿瘤的重量，观察抑制相应蛋白对体内血管瘤生长的影响。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.14 组HemECs VEGF-A和VEGF-C mRNA表达水平比较 4组HemECs VEGF-A和VEGF-C mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与control组相比，shVEGF-A组HemECs VEGF-A mRNA表达水平下降（P＜0.05），shVEGF-C组HemECs VEGF-C mRNA表达水平下降（P＜0.05），shVEGF-A+C组VEGFA和VEGF-C mRNA表达均水平下降（均P＜0.05），见图1。

图1 4组血管瘤内皮细胞（HemECs）血管内皮生长因子A（VEGF-A）和血管内皮生长因子C（VEGF-C）mRNA表达水平比较（与 control组比较，*P＜0.05）

2.2 4组HemECs生长情况比较 与control组比较，shVEGF-A组和shVEGF-C组HemECs均生长受限（均P＜0.05）；而shVEGF-A+C组比shVEGF-A组和shVEGFC组HemECs生长受限更明显（均P＜0.05），见图2。

图2 4组血管瘤内皮细胞（HemECs）生长情况比较（与control组比较，*P＜0.05；与 shVEGF-A+C 组比较，△P＜0.05）

2.3 4组HemECs增殖情况和细胞周期调节因子表达比较 与control组比较，shVEGF-A组和shVEGF-C组HemECs增殖均受抑制（均P＜0.05）；而shVEGF-A+C组比shVEGF-A组和shVEGF-C组HemECs增殖受抑制更明显（均P＜0.05）。与control组比较，shVEGF-A组细胞周期抑制因子p21表达水平升高（P＜0.05），细胞周期激活因子CyclinD1和CDK4表达水平降低（均P＜0.05）；shVEGF-C组细胞周期抑制因子p27表达水平升高（P＜0.05），细胞周期激活因子CyclinB2表达水平降低（P＜0.05）；shVEGF-A+C组比shVEGF-A组和shVEGF-C组HemECs细胞周期抑制因子p21、p27表达水平升高（均P＜0.05），细胞周期激活因子CyclinD1、CDK4表达水平降低（均P＜0.05）。见图3（插页）。

图3 4组血管瘤内皮细胞（HemECs）增殖情况和细胞周期调节因子表达比较（a为HemECs BrdU检测的代表性图像，红色为BrdU，蓝色为DNA；b为BrdU细胞百分比比较；c为细胞周期调节因子Western blot蛋白质印迹；d为细胞周期调节因子蛋白表达水平比较；与control组比较，*P＜0.05；与 shVEGF-A+C 组比较，△P＜0.05）

2.4 4组HemECs凋亡情况和凋亡相关蛋白表达水平比较 与control组相比，shVEGF-A组、shVEGF-C组HemECs中凋亡细胞百分比升高（均P＜0.05），而shVEGFA+C组比shVEGF-A组和shVEGF-C组HemECs中的细胞凋亡百分比更高（均P＜0.05）。与control组相比，shVEGF-A组HemECs促凋亡蛋白CYTC和caspase3表达水平均升高（均P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低（P＜0.05）；shVEGF-C组促凋亡蛋白 caspase9表达水平升高（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低（P＜0.05）。shVEGF-A+C组比shVEGF-A组和shVEGF-C组CYTC、caspase3和caspase9表达水平升高，Bcl-2表达水平降低。见图4。

图4 4组血管瘤内皮细胞（HemECs）凋亡情况和凋亡相关蛋白表达水平比较（a为流式细胞图比较；b为凋亡细胞百分比比较；c为凋亡相关蛋白Western blot蛋白质印迹；d为凋亡相关蛋白表达水平比较；与control组比较，*P＜0.05；与shVEGF-Atc组比较，△P＜0.05）

2.5 4组HemECs移植到裸鼠体内后肿瘤生长情况比较 与control组相比，shVEGF-A组和shVEGF-C组肿瘤均缩小，抑瘤率分别为25.35%、49.21%（均P＜0.05），而shVEGF-A+C组比shVEGF-A组和shVEGFC组肿瘤更小（均P＜0.05），抑瘤率为73.43%。见图5（插页）。

图5 4组血管瘤内皮细胞（HemECs）移植到裸鼠体内后肿瘤生长情况比较（a为肿瘤生物发光测定代表性图像；b为肿瘤发光图像定量比较；c为肿瘤大小整体视图比较；d为相关肿瘤重量比较；与control组比较，*P＜0.05；与shVE-A+C组比较，*P＜0.05）

3 讨论

VEGF家族由6种分泌氨基酸组成，其中VEGF-A可能在血管生成中起着最重要的作用[6]。然而，VEGF-A的确切作用可能需与其他成员相协调，因为VEGF成员和受体有一个复杂的配体-受体结合图[7]。值得注意的是，VEGF-C只与血管内皮生长因子受体（vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR）3 结合，通过 VEGFR3促进淋巴管生成，这与VEGF-A和VEGFR 2介导的血管生成不同[8]。本研究结果发现，VEGF-A和VEGF-C的联合抑制对HemECs的生长有更显著的限制作用，因此血管新生和淋巴管生成都是导致血管瘤恶性生长的重要因素。

本研究结果发现VEGF-A或VEGF-C的抑制似乎通过不同的信号转导途径影响细胞增殖。例如，VEGF-A抑制细胞周期蛋白D1和CDK4表达，后者形成调控复合物来控制G1/S转换[9]。VEGF-E抑制CyclinB2，CyclinB2主要控制G2/M转变[10]。VEGF-A抑制不改变CyclinB2，VEGF-E抑制不改变CyclinD1和CDK4。此外，由于VEGF-A和VEGF-E的抑制作用分别增加了2个G1检查点CDK抑制物p21和p27[11]，这些数据表明VEGF-A促进HemECs的增殖可能主要通过促进G1/S转换，而VEGF-E可能通过促进G1/S转换和G2/M转换促进HemECs的增殖。因此可以理解，抑制VEGF-A和VEGF-E对HemECs有更显著的抗增殖作用。

同样，本研究结果显示VEGF-A或VEGF-C的抑制作用可能通过不同的信号转导途径影响细胞凋亡。CYTC通过Apaf1和pro-caspase9产生凋亡体，将procaspase9切割成活性二聚体caspase9，介导caspase3的切割[12]。显然，VEGF-A和VEGF-C信号传导控制着细胞凋亡的不同阶段。因此，同时抑制VEGF-A和VEGFC对HemECs有更显著的促凋亡作用。

综上所述，本研究结果显示，VEGF-A和VEGF-C通过信号通路中的不同蛋白调节HemECs的增殖和凋亡。VEGF-A和VEGF-C双拮抗在体内外对血管瘤内皮细胞增殖的抑制作用更为明显。