ACAT1低甲基化在儿童肾病综合征发病机制中的作用研究

杨建环 王德选 陈敏广 邢超

儿童原发性肾病综合征主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和水肿，微小病变型是最常见的病理类型[1]。目前原发性肾病综合征的发病机制尚不明确，机体免疫功能紊乱可能参与疾病的发生。酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase，ACAT）是一种细胞内催化胆固醇代谢的酶，它将细胞内游离的胆固醇催化为胆固醇酯的形式并储存在细胞内，从而维持细胞膜的胆固醇稳态[2]。目前已鉴定出两个ACAT基因（ACAT1和ACAT2），其中ACAT1广泛表达，ACAT2主要表达于肝脏和小肠[3]。研究发现ACAT1表达上调可导致脂质在慢性肾脏病大鼠的肾脏中沉积；而肾脏中脂质积聚可加速肾脏疾病的进展[4]。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，通常发生在基因启动子区域的CpG岛上。研究发现，基因启动子区的DNA甲基化状态通常与基因转录失活有关，而去甲基化状态则与基因转录激活有关[5]。既往研究发现，DNA甲基化异常影响着基因的表达和疾病的发展。而多项研究表明肾病综合征的发病可能与表观遗传改变有关[6-7]；笔者团队前期研究也发现肾病综合征患儿的基因组总体甲基化水平降低[8]。目前有关DNA甲基化异常是否影响肾病综合征患儿ACAT1基因表达的研究不多。基于此，本研究通过分析肾病综合征患儿ACAT1基因启动子的甲基化水平，探讨ACAT1甲基化异常在儿童肾病综合征发病机制中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年6月至2019年12月温州医科大学附属第二医院收治的原发性肾病综合征患儿16例，为肾病组，纳入标准：（1）蛋白尿：尿白蛋白＞50 mg/（kg·d），或随机尿白蛋白/尿肌酐＞2 mg/mg；（2）低蛋白血症：血清白蛋白＜25 g/L；（3）激素治疗敏感：4 周内缓解；（4）年龄＜16周岁。排除标准：（1）先天性或遗传性肾病综合征；（2）继发性肾病综合征（过敏性紫癜肾炎、狼疮性肾炎等）。另择同时期来医院体检的健康儿童16例为对照组。两组患儿性别、年龄、WBC、Hb、PLT、血尿素氮、血肌酐水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），肾病组患儿血浆白蛋白水平低于对照组（P＜0.05），胆固醇水平、尿白蛋白/尿肌酐高于对照组（均P＜0.05），见表1。本研究经医院医学伦理委员会批准，并经研究对象家属知情同意。

表1 两组患儿一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 ACAT1基因启动子甲基化水平检测 采用亚硫酸氢盐测序法。取患儿外周静脉血1 ml，用血液基因组DNA提取试剂盒（中国天根生物有限公司）提取全血基因组DNA（操作过程参考说明书）。采用德国Qiagen公司EpiTect bisulfite kit试剂盒对基因组DNA进行亚硫酸氢钠修饰（操作过程参考说明书）。经亚硫酸氢钠修饰后，非甲基化的DNA序列中所有的脱氧胞嘧啶（C）均被转变为脱氧尿嘧啶（U）；而甲基化CpG岛中的脱氧胞嘧啶（C）不会被亚硫酸氢钠反应，仍然保持CpG序列。将转化后的DNA模板送检上海生工生物公司测序，检测ACAT1基因启动子的甲基化水平。

1.2.2 ACAT1及DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）mRNA表达水平检测 取患儿外周静脉血1 ml，采用Ficoll法提取外周静脉血单个核细胞，采用Trizol法提取单个核细胞的总mRNA，逆转录成第一链cDNA。qPCR法检测ACAT1 mRNA及Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表达水平。反应体系20 μl，包括10 μl FastStart Universal SYBR Green Master的PCR反应试剂（瑞士Roche公司）、每个引物各1 μl（300 nmol/L）、2 μl cDNA 模板和 6 μl去离子水，并在 Roche LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪器中进行PCR扩增，反应条件为 95℃预变性 5 min，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃20 s，共40个循环。所有样本均设置两个副管，以βactin作为内参，引物设计见表2。数据结果以2-ΔCt相对定量表示。

表2 引物设计

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾病组患儿和对照组儿童ACAT1 mRNA表达水平比较 肾病组患儿和对照组儿童ACAT1 mRNA表达水平分别为0.14±0.02和0.07±0.01，肾病组高于对照组（P＜0.05），见图1。

图1 肾病组患儿和对照组儿童酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）mRNA 表达水平比较

2.2 肾病组患儿和对照组儿童ACAT1基因启动子的甲基化水平比较 BSP测序结果显示ACAT1基因启动子中共有26个CpG岛，肾病组患儿和对照组儿童ACAT1基因启动子的甲基化水平分别为2.36±0.58和4.76±0.81，肾病组低于对照组（P＜0.05），见图2。

图2 肾病组患儿和对照组儿童酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）基因启动子的甲基化水平比较

2.3 肾病组患儿和对照组儿童Dnmt mRNA表达水平比较 肾病组患儿和对照组儿童Dnmt1 mRNA表达水平分别为 0.05±0.01 和 0.09±0.01（P＜0.05），Dnmt3a mRNA表达水平分别为 0.07±0.01和 0.06±0.01（P＞0.05），Dnmt3b mRNA 表达水平分别为 0.08±0.01 和0.06±0.01（P ＞0.05），见图3；提示肾病组患儿 ACAT1基因启动子的低甲基化水平可能与Dnmt1 mRNA表达水平降低有关。

图3 肾病组患儿和对照组儿童DNA甲基化转移酶（Dnmt）mRNA表达水平比较

2.4 ACAT1甲基化水平、mRNA表达水平与胆固醇水平的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，ACAT1甲基化水平与胆固醇水平呈负相关（r=-0.39，P＜0.05），ACAT1 mRNA表达水平与胆固醇水平呈正相关（r=0.36，P＜0.05），见图4-5。由于肾病组患儿存在高胆固醇血症，推测肾病综合征患儿的胆固醇代谢异常可能与ACAT1基因表达异常相关。

图4 酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）甲基化水平与胆固醇水平的相关性分析散点图

图5 酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1（ACAT1）mRNA表达水平与胆固醇水平的相关性分析散点图

3 讨论

原发性肾病综合征并发症包括动脉粥样硬化和血栓栓塞，可能与机体脂质代谢失调和血脂异常有关[9]。ACAT可促使胆固醇的酯化，在维持细胞胆固醇稳态中起重要作用[10]。ACAT1表达上调可促进泡沫细胞的形成，加速肾脏疾病的进展[11]。本研究发现肾病组患儿ACAT1 mRNA表达水平升高，可能与肾病综合征患儿脂质代谢异常及高胆固醇有关；同时ACAT1表达水平升高可调节T细胞的胆固醇代谢，促进CD8+T的增殖，影响机体T细胞的免疫状态[12]，从而参与肾病综合征的免疫功能紊乱。然而，本研究是基于临床病例对照的研究，可能存在抽样误差，还需要进一步大样本论证。

DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸的5'侧胞嘧啶上，而绝大多数CpG位点在细胞的整个周期中保持着甲基化状态[13-14]。基因组中富含CpG位点的片段称为CpG岛，主要处于启动子区域，而CpG岛的甲基化状态可直接导致相关基因转录沉默[15]。研究发现，在ACAT1基因启动子中有4个Sp1元件和1个IFN-γ激活序列[16]。其中IFN-γ是一种促进动脉粥样硬化的细胞因子，它通过与IFN-γ激活序列结合可上调单核巨噬细胞ACAT1 mRNA表达[17]，但对其它类型细胞则无此作用。本研究发现肾病综合征患儿ACAT1基因启动子中有26个CpG岛，相对于对照组，其ACAT1基因启动子甲基化水平降低。由于DNA甲基化通常与基因转录失活有关，而去甲基化则与基因转录激活有关，因此推测肾病综合征患儿ACAT1基因启动子的低甲基化水平可能与ACAT1 mRNA表达水平升高相关。

Dnmt是体内催化DNA胞嘧啶残基甲基化的主要反应酶，在哺乳动物细胞中主要包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b，它们之间具有协同作用，维持体内DNA甲基化稳定[18]。在正常成人中Dnmt1呈持续性的低表达状态[19]，从而使人体内部分基因呈去甲基化状态。既往研究发现，糖尿病db/db小鼠肾皮质中Dnmt1而非Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达水平升高[20]。本研究发现肾病组患儿Dnmt1 mRNA表达水平降低，而Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达水平与对照组比较无统计学差异。因此笔者推测原发性肾病综合征患儿ACAT1基因启动子的低甲基化水平可能与Dnmt1mRNA的表达水平降低相关。

综上所述，肾病综合征患儿ACAT1基因启动子呈低甲基化状态，可能与Dnmt1 mRNA表达下调有关，从而使胆固醇代谢出现异常。这为临床治疗儿童原发性肾病综合征提供新的思路。