p16/Ki-67免疫组化染色阳性对宫颈低级别鳞状上皮内病变临床处理的意义

刘艳勃 李武 吕雯 谢继平 陈琳琳

随着宫颈癌筛查的推广，较多的宫颈癌前病变被及时发现。宫颈低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的临床处理存在争议，因仍有一部分LSIL持续甚至进展[1]，临床采取长期随访，但会增加患者不必要的紧张及焦虑情绪。故对有高级别病变风险的宫颈LSIL，临床应考虑如何更好地识别及采取有效合理的处理方式，以减少更高级别病变的漏诊及不必要的长期随访所带来的精神困扰。p16为抑癌基因，其相关蛋白即p16是细胞周期依赖性激酶抑制剂，多种肿瘤中都表达下调，但在宫颈病变中表达上调[2-3]（因HPV感染抑制了其负反馈，导致其过度表达）。Ki-67是仅存在细胞核中的蛋白质，与p16的作用相反，存在于除G0期的其他细胞各个周期，是反映细胞增殖程度的有效标志物。基于此，本研究分析经阴道镜活检宫颈组织p16及Ki-67免疫染色阳性的宫颈LSIL患者潜在高级病变的可能性，探讨是否有部分宫颈LSIL患者需直接行宫颈锥切术，而不是长期随访。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年1月至2018年12月浙江省立同德医院收治的经阴道镜活检宫颈组织病理学结果提示宫颈LSIL的已育患者146例，均行宫颈锥切术治疗，术前均行 HPV 检测，年龄 24～68（43.8±10.9）岁。宫颈LSIL诊断标准：组织学上呈鳞状上皮基底及副基底样细胞增生，细胞核极性轻度紊乱，有轻度异型性，局限于上皮下1/3层。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 宫颈组织p16/Ki-67免疫组化染色 p16鼠抗人单克隆抗体试剂（克隆号：16P04/IC2）、Ki-67小鼠抗人单克隆抗体试剂（克隆号：UMAB107）均购于无锡傲锐东源生物科技有限公司。制备石蜡组织切片，脱蜡、水化，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，滴加p16或Ki-67抗体试剂，滴加酶标羊抗鼠IgG聚合物，滴加显色剂，复染，脱水、透明、封片。待p16/Ki-67免疫组化染色完成，用图像采集软件的高倍成像显微镜采集图像，将获取的图片进行分析。病理切片由2位病理医生进行判读。

1.2.2 p16/Ki-67免疫染色结果评判标准 （1）p16表达于细胞核和/或细胞质，鳞状上皮的基底和基底旁细胞层连续性着色为阳性。呈棕黄色，如点状、灶状着色或无着色均为阴性。（2）Ki-67表达于细胞核，细胞定位于基底层以上为阳性，局限于基底层为阴性；呈黄褐色。根据上皮组织Ki-67免疫组化染色阳性细胞量进行染色程度分类，≤25%+，25%～50%++，＞50%+++。其中 p16、Ki-67同一组织切片染色均阳性者以下简称为染色阳性，其余情况为染色阴性。

1.3 宫颈锥切术及术后随访 常规外阴阴道消毒后，暴露宫颈，复方碘溶液涂抹宫颈，于宫颈碘不着色外0.3～0.5 cm处手术刀行环形切开，逐步向宫颈内口方向做锥形切除。根据患者年龄、生育需求酌情控制宫颈锥切深度：对于年轻、有生育要求者锥切深度控制在1.0～1.5 cm；无生育要求者宫颈切除深度控制在1.5～2.5 cm[4]。切除后行宫颈成形缝合，切除的宫颈锥切组织12点缝线标记，送病理科进一步行免疫组化染色，由2位病理科医生进行结果判读。宫颈锥切病理提示高级别鳞状上皮内病变（high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）视为病理升级；LSIL视为病理相符，黏膜慢性炎及以下视为降级。术后3、6个月行宫颈液基细胞学及HPV联合检查，如异常根据情况必要时行经阴道镜下宫颈活检。

1.4 观察指标 （1）观察患者宫颈锥切术后病理学结果；（2）比较p16/Ki-67免疫组化染色阳性与阴性患者术后病理学结果；（3）分析患者宫颈组织Ki-67免疫组化染色程度与术后病理学结果的相关性；（4）观察患者宫颈锥切术前与术后HPV检测结果。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计数资料以频数和构成比表示，两组比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈锥切术后病理学结果 146例宫颈LSIL患者宫颈锥切术后病理学结果显示，黏膜慢性炎36例（24.65%），LSIL 91例，HSIL 19例。符合率为62.33%（91/146），病理升级率为13.01%（19/146）。典型患者宫颈锥切术后病理学结果见图1-3（插页）。

图1 典型患者宫颈锥切术后病理示黏膜慢性炎（a为HE染色；b为p16染色；c为Ki-67染色；×50）

图2 典型患者宫颈锥切术后病理示低度鳞状上皮内病变（a为HE染色；b为p16染色；c为Ki-67染色；×50）

图3 典型患者宫颈锥切术后病理示高级别鳞状上皮内病变（a为HE染色；b为p16染色；c为Ki-67染色；×50）

2.2 p16/Ki-67免疫组化染色阳性与阴性患者术后病理学结果比较 染色阳性与阴性患者分别为91、55例。染色阳性患者中病理升级者所占比例明显高于染色阴性患者，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 p16/Ki-67免疫组化染色阳性与阴性患者术后病理学结果比较[例（%）]

2.3 患者宫颈组织Ki-67免疫组化染色程度与术后病理学结果的相关性 患者宫颈组织Ki-67免疫组化染色程度与术后病理学结果呈正相关（r=0.335，P＜0.05），见表2。

表2 患者宫颈组织Ki-67免疫组化染色程度与术后病理学结果的相关性

2.4 患者宫颈锥切术前与术后HPV检测结果 术前，存在高危型HPV感染135例（其中HPV 16/18型77例），HPV阴性11例。术后3个月仍有HPV感染者15例，此15例术前均有HPV感染。持续随访，其中有8例于术后6～24个月转阴。宫颈锥切术后3个月HPV转阴率为 88.89%（120/135），总的转阴率为 94.81%（128/135），见表3。

表3 患者宫颈锥切术前与术后3个月HPV检测结果（例）

3 讨论

目前临床关于经阴道镜活检宫颈组织病理学为LSIL的处理建议是定期随访，2年后，如果经阴道镜活检证实宫颈组织病理学仍为LSIL及以上再行宫颈锥切术[5]。但经阴道镜活检病理学为LSIL者存在有病理学诊断不准确[6]、仍有一定病变持续及进一步进展、仍有HSIL的漏诊的风险。Coppock等[7]对92例原宫颈组织活检诊断为LSIL的患者，由3位妇科病理医师根据形态学的一致意见进行重新分类。结果表明，6.5%（92例原诊断为LSIL者有6例）为HSIL，只有44.5%（92例原诊断为LSIL者中41例）确定为LSIL。有研究指出，经阴道镜下宫颈组织活检诊断宫颈上皮内瘤变的准确率为43.40%～74.70%[8]。其次，长期随访的数据表明，宫颈组织活检病理结果为LSIL者，仍有一定病变持续及进一步进展。Huang等[9]随访了宫颈组织活检证实的109例LSIL者，随访时间为12～86.3个月不等，其中转为阴性者85.3%，持续LSIL者7.3%，进展为HSIL者7.3%。王荣敏等[10]对104例宫颈组织活检病理学结果为LSIL的患者进行随访，1年后行TCT及HPV联合检测，异常者则再次行经阴道镜检查，其中78.8%患者病变消退，9.6%患者病变持续仍为LSIL，4.8%病变进展为HSIL。据报道阴道镜下活检诊断LSIL者中HSIL病变的漏诊率约为19.00%～55.00%[7]。本研究中，经阴道镜活检病理为LSIL患者中经宫颈锥切术证实HSIL的漏诊率为率为13.01%。

虽然2012年美国病理学会和美国阴道镜与宫颈病理协会对癌筛查的联合指南中指出，p16蛋白可一定程度上弥补病理检查结果的准确性及可重复性低的不足，但p16蛋白抗体表达对于诊断低级别宫颈上皮内病变仍存在一定的漏诊率。p16的免疫组化对病理的形态学判读的辅助作用缺乏敏感性及特异性[11-12]。但Ki-67已被证实是HPV感染的敏感特异性标志物[13]。Gashi等[14]建议用p16/Ki-67免疫组化双染色对LSIL的病理诊断有较好的价值。相关研究表明，p16免疫组化染色程度随宫颈疾病严重程度增加而增加，Ki-67免疫组化染色程度与宫颈疾病的严重程度呈正相关，其表达较高则表示癌前病变的发生及进展会进一步增强[15-16]。p16/Ki-67双免疫检测可很好地识别出宫颈HSIL风险较高的妇女[17]。本研究证实，双染色阳性患者中病理升级者所占比例明显高于双染色阴性患者，提示双染色阳性可以提示宫颈病变持续及漏诊更高级别病变的概率增加。患者宫颈组织Ki-67免疫组化染色程度与术后病理学结果呈正相关，随着染色程度的的增加，术后病理级别逐渐升高。Ki-67免疫组化染色程度可以辅助宫颈组织活检病理为LSIL者进一步分层管理，对于染色程度较重者，要引起高度重视。

美国妇产科医师协会在2016年宫颈癌筛查指南中指出，对HPV感染的焦虑与羞耻是参与宫颈癌筛查女性极为担心的问题，也是临床宫颈癌筛查决策中重点要考虑的问题。长期随访，对患者依从性要求较高，会增加患者对病变的焦虑情绪，对患者精神及物质层面会造成不可低估的影响[18]。钟萍萍等[19]对174例宫颈组织活检病理证实为LSIL的患者进行随访，发现6、12个月HPV检测，转阴率仅为33.3%。既往随访的研究中高危型HPV的转阴率较低，转阴时间较长，且病理仍有相当一部分表现为持续。临床上很多患者得知自己感染HPV或者宫颈筛查的细胞学、组织学异常，出现失眠、焦虑甚至抑郁等倾向，这是必须高度重视的宫颈癌筛查环节。本研究结果提示，宫颈锥切术后3个月HPV转阴率为88.89%，可减少不必要的随访焦虑。

综上所述，对于经阴道镜活检宫颈组织LSIL者，若p16/Ki-67免疫组化染色阳性，特别是Ki-67免疫组化染色程度较重者，建议可直接行宫颈锥切术，而不是随访，避免高级别病变的漏诊、持续及进展，减轻患者的精神负担。