传统工艺酿造酱油微生物多样性与风味研究

邓岳，杨阳，梁丽静，迟原龙，孙群

(1.泸州职业技术学院，四川 泸州 646000；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000；3.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610064；4.四川大学 生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064)

中国酱油生产历史悠久，因其独特的风味和营养价值备受全球人民青睐[1]。传统酱油酿造采用的是长周期开放式的酿造工艺，酿造过程中涉及到自然界众多微生物菌系的参与，同时也受区域性温度、湿度等环境因素影响，因而拥有独特的风味[2]。

四川省泸州市先市镇的酿造历史最早可以追溯到汉朝，到唐朝时期已形成一套独特的酿制体系，拥有一家历时100多年的酱油老厂房和600多口百年以上的晒露缸，生产酱油采用手工作坊式的天然多菌种混合发酵工艺，在自然环境中日晒夜露3～5年，所产酱油具有独特风味和显著的区域特色。该酿造技艺于2014年被列入中国“非物质文化遗产”名录进行重点保护，其生产场所也被列为“四川重点文物保护单位”名录。

传统酿造酱油采用自然开放式发酵，微生物种类和数量繁多，发酵过程涉及到多种有益微生物的联合协同作用，通过微生物发酵糖类产生小分子醇类、醛类、酸类、酯类、酚类等风味物质，这是酱油风味产生的主要途径[3]。研究通过对传统工艺酿制酱油发酵过程中微生物数量和种类与产品风味特征物质进行分析，探究传统工艺酿造酱油风味特征与微生物之间的联系，明确传统工艺发酵酱油风味物质重要贡献微生物，为分离风味贡献菌株、提升酱油风味品质与工艺优化提供了参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品分别来自先市酿造发酵过程中的第0.5，1，2，3，4年，且不同年份的酱醅样品选取采用随机原则，均随机取自5口不同的酱缸(N=25)，分别编号为0.5～4-1～5。样品采集后，于4 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

各引物名称、序列组成及文献出处见表1，由Invitrogen(上海)贸易有限公司合成；细菌DNA提取试剂盒、酵母DNA提取试剂盒、植物DNA提取试剂盒、溶细胞酶(Lyticase)：北京天根公司；SYBR Green I：美国Sigma公司；Stool DNA Kit、Gel Extraction Kit：美国Omega公司；Premix Taq Version 2.0(loading dye mix)：日本Takara公司；D2000 DNA Marker。所有试剂均为分析纯。

表1 用于本研究PCR的引物Table 1 The primers for PCR in this study

1.3 主要仪器设备

Wide Mini-Sub Cell GT型水平电泳槽；S1000型PCR仪；PowerPac Basic型电泳仪电源；Universal Hood II型凝胶成像系统；UV-2450紫外分光光度计、2010-plus气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；手动进样器、固相微萃取头、75 μm CAR/PDMS 美国Supelco公司。

1.4 微生物的分离与鉴定

1.4.1 分离培养培养基

平板计数琼脂培养基(PCA)：5 g蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、1 g葡萄糖、15 g琼脂粉，补水至1 L，调节pH至7，灭菌。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：300 g土豆，洗净去皮切成小块，加适量水煮沸20 min。用8层纱布过滤，滤液加入20 g葡萄糖、18 g琼脂粉并补水至1 L，加热使其充分溶解，灭菌。在倒平板之前，需加入用少量乙醇溶解的0.1 g氯霉素，0.22 μm滤膜过滤到冷却至50 ℃左右的培养基中。

De Man, Rogosa, Sharpe琼脂培养基(MRSA)：10 g 蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母浸粉、20 g葡萄糖、2 g K2HPO4、2 g柠檬酸铵、5 g乙酸钠、0.58 g MgSO4· 7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1 mL吐温80、15 g琼脂粉，补水至1 L，灭菌。

1.4.2 菌株的分离和鉴定

根据培养基上的菌落形态和初步镜检观察，最大程度地随机挑选不同的特征菌落，然后进行反复的分离纯化后，进行扩大培养。待扩大培养完成后，利用相应的DNA提取试剂盒提取部分菌株DNA，并使用针对16S rDNA的通用引物对27 F/1492 R(细菌)或针对ITS rDNA的通用引物对ITS1/ITS4(真菌)对相应目的基因序列进行扩增，扩增产物送Invitrogen公司进行测序以供菌种鉴定。

1.5 风味物质的顶空固相微萃取

1.5.1 顶空固相微萃取条件

准确称量8 mL传统工艺酿制的先市酱油放置于顶空瓶中，加入1 g NaCl后密封，在40 ℃水浴锅中平衡20 min，采用安装有75 μm CAR/PDMS固相微萃取头的手动进样器，对先市酱油中的风味物质进行萃取，萃取时间为40 min。3个平行样品，每个样品手动进样2次。

1.5.2 GC-MS条件[6-7]

样品分别通过DP-5MS弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)进行分离；程序升温条件：起始温度40 ℃，以3 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；载气为高纯氦气(1.0 mL/min)；分流比10∶1。质谱条件：电子轰击电离(EI)离子源，电子能量70 eV；电子倍增器电压350 V；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；质量范围35～350 m/z；扫描速度3.00 scans/s。

通过计算机检索，同时利用NIST 08和WILEY 09谱库相互匹配进行定性分析。各组分相对含量按照峰面积归一化法计算。

1.6 数据分析

实验数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件的One-way ANOVA进行方差分析，并用LSD法和Dunnett＇s T3法进行事后两两比较分析，P≤0.05视为具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 可培养微生物的主要类群计数

发酵酱醅中可培养的主要微生物类群计数结果见图1。

图1 酱醅中不同微生物类群随发酵时间的变化

在整个酱醅发酵过程中，微生物(TMAB)的数量始终位居较高水平，菌落总数约为1×1010～1×1011CFU/g，在第一年这一时间点表现出小幅提升，并在第二年时略微下调，之后趋于平稳；在数量水平上，细菌的芽孢与TMAB表现相似，不同的是前者数量的波动范围更小，始终保持在1×1010CFU/g的水平；酵母的菌落总数在前两年中相对稳定，当发酵进行至中后期时下降了约两个数量级。

2.2 可培养微生物的分离和鉴定

根据微生物菌落形态，共挑选61株细菌、18株酵母及12株霉菌进行分子鉴定，具体结果见表2，各菌株与GenBank数据库检索得到的最相似模式菌株同源性均大于或等于99%。

表2 培养法获得微生物的种类及所占比例Table 2 The types and proportion of microorganisms obtained by culture method

续 表

所有细菌菌落被鉴定为Bacillus属，Bacillus优势显著，主要为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌三类。根据黄永光等的研究结果，芽孢杆菌能产生高活性的胞外产物酶，同时也会分泌大量自身生长需求和代谢合成风味产物所需要的酶系，例如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶等水解酶在研究中均被发现，这些复杂的酶系为代谢的通路和初级代谢产物及其次生代谢产物的形成提供了关键动力。根据Quan C S等的研究表明[8]，芽孢杆菌属在发酵过程中会产生独特的特征风味，呈现出辛香、甜香、蜂蜜香、醋酸香、油脂腐臭、奶酪香、水果香、芳香、醚香；奶油香、草莓果香、炒芝麻香、坚果香、青椒香、烤玉米香；玫瑰花香、杏仁香、异臭、略微氨臭味、酱香等特征性风味。

2.3 先市酱油挥发性风味物质

传统工艺酿造酱油HS-SPME气相色谱-质谱总离子流色谱图见图2。

图2 传统工艺酿造先市酱油HS-SPME气相色谱-质谱总离子流图Fig.2 GC/MS total ion chromatogram of Xianshi soy sauce brewed by traditional technology

由图2可知，传统工艺酿造的先市酱油中各种挥发性组分都取得了良好的分离效果，各色谱峰相应的质谱图经人工解析及计算机检索并结合相关文献，共鉴定出48种风味化合物，其中醇类(8种)、酯类(7种)、醛类(7种)、酸类(6种)、酮类(6种)、吡嗪类(4种)、呋喃类(3种)、含硫化合物(3种)、酚类(2种)及其他类(2种)。

由表3可知，传统工艺酿制酱油的风味成分中含量高的为酸类43%，醛类12%，呋喃类10%，醇类9%，其次为其他类、含硫类、酮类、吡嗪类、酯类。其中酸类物质共有6种，其中以乙酸为主。有机酸可以通过酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等多种微生物以三羧酸或丙酮酸循环代谢生成，有机酸的存在能赋予酱油酸味柔和、回味绵长的口感；醛类物质含量为12%，醛类物质主要来源于不饱和脂肪酸的降解，含量较高的为2-甲基丁醛、异戊醛、5-甲基呋喃醛、苯乙醛。其中，苯乙醛具有焦糖香、甜以及类似蜂蜜的风味，呈咖啡和可可香气，微带甜的水果和巧克力似风味。醇类物质占9%，其中以乙醇为主，一共检出8种醇类物质。以丁二醇为主，丁二醇是具有黄油和奶油香、甜味复杂的高级醇类化合物。酯类香味清淡，香味散逸快，逸散远，容易让人感觉到，在酱油中一共检测出7种酯类物质；杂环类化合物主要表现的是坚果香味和清香；吡啶类化合物、吡嗪类化合物具有强烈的水果香，其香气阈值浓度极低，香气透散性好；3种呋喃类香味物质和4种吡嗪类化合物在酱油中被检测出，其中以2,6-二甲基吡嗪为主；含硫化合物是含硫氨基酸经过美拉德反应后通过Strecker降解产生，在火腿、烤肉中被检测出，具有焦香、烤香、烧烤味，呈味阈值低，对产品风味影响大，一共检测出3种含硫化合物，在酱油中含量为3%；其他类中检测出2种，其中2-乙酰基吡咯具有烤面包香，为焦糖香化合物。

表3 传统工艺酿制先市酱油风味物质相对含量(%)Table 3 The relative content (%) of volatile components of Xianshi soy sauce brewed by traditional technology

许延涛等的研究表明[9]，芽孢杆菌属可通过糖酵解、磷酸戊糖等一系列糖代谢途径和柠檬酸循环；丙酮酸代谢等中间节点代谢、丙氨酸代谢、酪氨酸和苯甲酸降解羟化等氨基酸代谢途径[10]；膦酸酯和膦酸代谢、硫胺素代谢、维生素B6代谢、核黄素代谢等其他途径合成大量风味物质，例如丙酮酸代谢途径最终产物有乙醇、乙醛、乙酸、丙酮、丁醛、异丙醇、丁醇、丁酸等化合物；L-苏氨酸代谢途径产物合成吡嗪类化合物；苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢途径产物为合成乙酸、丁酸等有机酸类物质和苯乙醇、苯乙醛等风味化合物[11]；α-乙酰乳酸途径合成丁二醇，代谢途径合成醛类、酮类、吡嗪类、呋喃类风味物质[12]，这与杨帆等研究得出从茅台酱香型白酒生产大曲酒醅中分离产酱香风味的芽孢杆菌类功能菌发酵代谢风味物质种类比较丰富，特别是吡嗪类、含硫化合物、醛类、酮类、酯类等种类和含量较高的结论一致，也与发酵过程中传统工艺酿造酱油中微生物芽孢杆菌所占的种类、数量、比例的变化规律相吻合。

3 结论

为探究传统工艺酿造酱油的微生物多样性与风味特征品质，采用传统培养法，分析传统工艺酿造酱油中微生物的多样性。结果显示：在整个酱醅发酵过程中，微生物的数量始终居于较高水平，菌落总数约为1×1010～1×1011CFU/g，在第一年时间点表现出小幅提升，在第二年时略微下调，之后趋于平稳；在数量水平上，细菌的芽孢与微生物总量表现相似，不同的是前者数量的波动范围更小，始终保持在1×1010CFU/g的水平；酵母的菌落总数在前两年相对稳定，当发酵进行至中后期时下降了约两个数量级；并从先市酱油发酵过程中分离出61株细菌、18株酵母及12株霉菌，其中芽孢杆菌主要有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌三类。用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法对其挥发性风味成分进行定性定量。从发酵4年的酱油中，共鉴定出48种风味化合物，其中醇类(8种)、酯类(7种)、醛类(7种)、酸类(6种)、酮类(6种)、吡嗪类(4种)、呋喃类(3种)、含硫化合物(3种)、酚类(2种)及其他类(2种)。Zhao X等的研究表明[13]，酱油中风味物质产生机制与微生物组成分析表明，芽孢杆菌类微生物是先市酱油中酸类、酮类、含硫类、吡嗪类等低阈值化合物合成的重要微生物，芽孢杆菌属可能对先市酱油独特风味的形成起决定性作用。下一步从先市酱油中筛选出对酱油风味形成具有重要贡献的芽孢杆菌，并将其优化改良后用于现代工艺酿制酱油中改善风味不足、酒精味过重、产品质量不高等问题[14]，从而提升现代工艺酿制酱油的风味和质量。