河鲀发酵鱼酱游离氨基酸分析

钱小丽

(江苏旅游职业学院 烹饪科技学院，江苏 扬州 225127)

1 概述

水产品由于蛋白质含量高，所以在研究水产品加工中，水产品蛋白质的变化一直是人们研究的热点。蛋白质在发酵过程中会出现降解，生成多肽或者变为氨基酸等[1]。而在很多发酵制品中，如鱼露、酸肉、火腿、香肠等，在其整个发酵过程中，基于微生物发酵剂的功能，制品的游离氨基酸含量或多或少呈现增加状态，当然不同的微生物发酵剂对制品的游离氨基酸含量的影响情况也不同[2-5]。

游离氨基酸(free amino acid，FAA)除了应有的营养功能外，也作为呈味物质的重要成分，每一种氨基酸都有其独特的呈味特性，主要包括甜味、酸味、苦味、鲜味等。当不同的氨基酸混合到一起时会产生复杂的味道并使产品产生特殊的风味[6]。水产品中游离氨基酸含量丰富，Park等对7个国家多个鱼露品种分析认为鱼露的主要氨基酸为天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸[7]。赖氨酸能够改变产品的滋味，而鲜味的有效成分主要是谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸[8]。

当下国内外研究人员对游离氨基酸的研究主要是针对火腿、香肠等肉制品和豆酱等豆制品，而在水产中主要集中在自然发酵的鱼露，对于利用微生物发酵剂进行接种发酵对产品游离氨基酸影响的研究比较少，而以河鲀鱼为原料，研究利用微生物发酵剂接种发酵鱼酱的游离氨基酸的影响还未见报道。

本实验以河鲀鱼肉为原料，研究河鲀鱼肉在接种不同微生物发酵剂后所形成的游离氨基酸变化趋势，从而为开发并强化河鲀鱼酱品质提供了理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料

河鲀鱼肉、食盐、混合香料、植物油、锡箔纸、封口

膜：市售；乳酸菌L003、葡萄球菌C07、酵母菌Y04：以上菌种均由本实验室保存；试剂：磺基水杨酸、茚三酮、柠檬酸、柠檬酸钠、蛋白氨基酸标准品(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)。

2.2 主要仪器与设备

YXO.SGH280型高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂；SW-CJ-1F型超净工作台 苏州净化设备有限公司；TG16型高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机厂；HG101-2型电热鼓风干燥箱 南京实验仪器厂；HSX型控温控湿培养箱 上海福玛设备有限公司；FJ-200型高速均质仪 上海标本模型厂；L-8300型氨基酸自动分析仪 日本日立公司；BSA124S-CW型电子天平 赛多利斯(中国)有限公司；85-1A型磁力搅拌器 上海闵行虹浦仪器厂。

2.3 试验方法

2.3.1 河鲀鱼酱的加工

备选菌株在液体培养基中30 ℃培养12 h，离心(4 ℃，4000 r/min)10 min，去掉上清液，并用适当体积的无菌生理盐水稀释菌体，按指定添加量添加。

基本配方：河鲀鱼肉200 g、食盐16 g、植物油10 g、香辛料1 g、水100 g。

制备流程：原料肉预处理→绞碎→拌料接种→发酵→调配→蒸制→装袋→成品。

2.3.2 样品制备

取样品1 g，滴入8%的磺基水杨酸10 mL，用高速均质机均质后，4 ℃下以10000 r/min离心20 min，取上清液过滤，同温度下以20000 r/min离心15 min，通过氨基酸自动分析仪检测上清液。

2.3.3 测试条件

分离柱：Na+型离子交换柱(4.6 mm×60 mm)；柱温：57 ℃；树脂：日立8800；茚三酮流速：0.35 mL/min；缓冲液：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；缓冲液流速：0.4 mL/min；蛋白氨基酸标准品：10 nmol；检测波长：λ1=570 nm，λ2=440 nm；进样量：20 μL；50 min程序上机定量分析。

2.3.4 数据处理

每个样品进行3次试验，计算其平均值。用SPSS 17.0和Excel 2003对试验数据进行分析，数据采用单因素方差分析(ANOVA)，当P<0.05时表示差异性显著。

3 结果与分析

3.1 河鲀发酵鱼酱游离氨基酸的测定结果

由表1可知，共检出了17种游离氨基酸，与对照组比较，各组游离氨基酸总量均有所增加，尤以三菌复合发酵组游离氨基酸总量最高，均超过了各单菌发酵组。

表1 不同处理游离氨基酸的含量(g/100 g干物质)Table 1 The content of free amino acids (g/100 g dry substance)by different treatments

3.2 不同处理对游离氨基酸的影响

由图1可知，除苯丙氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、脯氨酸外，乳酸菌发酵的河鲀鱼酱与空白对照组相比，其他氨基酸的含量均有不同程度的提高，分别为苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸；从氨基酸含量分析，在L处理组中赖氨酸(0.042 g/100 g)、丙氨酸(0.024 g/100 g)、谷氨酸(0.017 g/100 g)的含量比较高；在L处理组中，出现了组氨酸，而空白处理组中未出现。

图1 L处理组与空白对照组CK游离氨基酸含量比较

由图2可知，葡萄球菌发酵的河鲀鱼酱与空白对照组进行对比，除苯丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸外，其他氨基酸的含量都或多或少有所提高，其提高的情况按序排列为：苏氨酸>丝氨酸>谷氨酸>丙氨酸>缬氨酸>蛋氨酸>异亮氨酸>亮氨酸；从氨基酸含量来看，在C处理组中含量较高的是赖氨酸(0.028 g/100 g)、丙氨酸(0.022 g/100 g)。除此之外，在C处理组中产出了组氨酸，但没有精氨酸产出。

图2 C处理组与空白对照组CK游离氨基酸含量比较

由图3可知，酵母菌发酵的河鲀鱼酱与空白对照组对比，除丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸外，其他氨基酸的含量均有一定程度的提高，具体排序为：苏氨酸>丙氨酸>缬氨酸>蛋氨酸>异亮氨酸>亮氨酸；从氨基酸含量来看，在C处理组中苯丙氨酸(0.022 g/100 g)、赖氨酸(0.021 g/100 g)的含量较高。与此同时，Y处理组中出现了组氨酸。

图3 Y处理组与空白对照组CK游离氨基酸含量比较

由图4可知，复合菌发酵的河鲀鱼酱与空白对照组对比，除酪氨酸、精氨酸、脯氨酸外，其他氨基酸的含量均有一定的提高，依次为苏氨酸>丝氨酸>谷氨酸>丙氨酸>缬氨酸>蛋氨酸>异亮氨酸>亮氨酸；从氨基酸含量来看，在C处理组中赖氨酸(0.052 g/100 g)、丙氨酸(0.023 g/100 g)含量较高。在S处理组中产生了组氨酸，但没有出现胱氨酸。

图4 S处理组与空白对照组CK游离氨基酸含量比较

由图5可知，单菌发酵、复合菌发酵与空白对照组对比，不同处理组的游离氨基酸含量变化显著。综合分析，复合发酵组游离氨基酸好于单菌发酵组，接菌发酵好于空白对照组。

图5 不同处理组游离氨基酸含量比较

3.3 河鲀发酵鱼酱不同类型氨基酸的比较

游离氨基酸品种十分丰富，为了进一步探讨接菌发酵与空白发酵之间游离氨基酸的不同，根据游离氨基酸的不同作用，将其分为必需氨基酸和非必需氨基酸两种不同的种类，其中必需氨基酸包括Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His，非必需氨基酸包括Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Tyr、Arg、Pro；按照呈味不同可分为鲜味氨基酸(Asp、Glu)、甜味氨基酸(Ser、Ala、Thr、Pro、Gly)和苦味氨基酸(Val、Leu、Ile、Tyr、Lys、Arg、Phe)等[9]。

由图6可知，除C处理组与Y处理组的苯丙氨酸、赖氨酸不如空白处理组外，其他各处理组的必需氨基酸含量均比空白处理组高；空白处理组中没有组氨酸出现，在L组、C组、Y组与S组中，均出现了组氨酸，其含量为0.003 g/100 g。

图6 不同处理组必需氨基酸含量比较

由图7可知，各接菌发酵处理组的非必需氨基酸含量没有显著不同，但Glu的含量高于空白处理组，Cys在各处理组中都没有发现。

图7 不同处理组非必需氨基酸含量比较

由图8可知，对于鲜味氨基酸来说，主要以谷氨酸为主，单菌发酵与复合菌发酵处理组的谷氨酸均比空白对照组高，具有显著性差异。

图8 不同处理组鲜味氨基酸含量比较

由图9可知，不同处理组对河鲀发酵鱼酱的甜味氨基酸含量作用不一致。对甜味贡献较大的主要是甘氨酸与脯氨酸。

图9 不同处理组甜味氨基酸含量比较

由图10可知，不同处理组对河鲀发酵鱼酱的苦味氨基酸含量影响不一致。对苦味作用较大的主要是赖氨酸、苯丙氨酸。

图10 不同处理组苦味氨基酸含量比较

由图11可知，接菌发酵组的必需氨基酸、鲜味氨基酸、甜味氨基酸、非必需氨基酸的含量总体上都要高于空白处理组，而对于苦味氨基酸来说，除了S复合发酵组外，其他各发酵组均低于空白发酵组。综合分析，接菌发酵的河鲀发酵鱼酱比空白发酵组好。

图11 河鲀发酵鱼酱中不同类型氨基酸的比较

各接菌发酵组中必需氨基酸含量比CK组高，必需氨基酸含量由高到低依次为S组>C处理组>L处理组>Y处理组>CK处理组。

河鲀发酵鱼酱中S组、C处理组、Y处理组的非必需氨基酸含量比CK组高，非必需氨基酸含量由高到低依次为Y处理组>S处理组>C处理组>CK处理组>L处理组。

各接菌发酵组中产鲜味氨基酸含量比CK组高；处理组的甜味氨基酸含量比其他组高；苦味氨基酸含量除S处理组外，接菌发酵组小于空白对照组。

4 讨论

4.1 微生物发酵剂对河鲀发酵鱼酱FAA含量的影响

游离氨基酸尤其是必需氨基酸对人体健康有着重要的作用。必需脂肪酸含量的多少将会影响产品品质的优劣。肌肉组织中的蛋白质水解产生的多肽类物质进一步被分解成小分子肽和氨基酸，通常认为其原因是微生物酶和组织内源酶的共同作用。河鲀发酵鱼酱中必需氨基酸含量都不同，CK组中必需氨基酸含量小于各接菌发酵组。进而可以猜测是发酵剂对河鲀发酵鱼酱产生了作用，而许多学者也认为发酵剂的蛋白酶等酶系能对蛋白质产生作用，比如乳杆菌分泌的蛋白酶能对肌肉中的蛋白质产生一定作用[10]。

根据不同发酵处理组的必需氨基酸来研究，S复合发酵组、C处理组、L处理组和Y处理组发酵的河鲀鱼酱含量不一致，这说明不同的微生物发酵剂对游离氨基酸含量的影响也是不同的，这可能与微生物本身的酶活能力有关。李平兰认为木糖葡萄球菌比戊糖乳杆菌具有更强的解离蛋白质产生游离氨基酸的能力[11]。Montel等研究发现葡萄球菌在发酵和成熟过程中能产生蛋白酶和脂肪酶降解蛋白质和脂肪，使其分解为小分子物质，对产品的风味具有重要作用[12]。

河鲀发酵鱼酱必需氨基酸含量由高到低依次为S组>C处理组>L处理组>Y处理组>CK处理组，各处理组的FAA总量和必需氨基酸含量低于复合菌株发酵组S组，且差异明显(P<0.05)。这一情况可能是因为不同菌群之间出现的新陈代谢作用引发了复合发酵的效果比单菌发酵好。

4.2 发酵对河鲀发酵鱼酱FAA种类及含量的影响

本次所测的18种氨基酸中，除胱氨酸在各处理组中均未检出，其余17种氨基酸基本上都在各处理组中出现，这与邓捷春等研究分析暗纹东方鲀与红鳍东方鲀背肉游离氨基酸组成的结果基本一致[13]。

微生物的代谢活动不仅促进了游离氨基酸的数量增长，同时也改变了游离氨基酸种类的构成，在S复合发酵组、C处理组、L处理组和Y处理组中均出现了组氨酸，而在CK空白处理组并未出现。在L处理组中酪氨酸并未检出；精氨酸在C处理组和L处理组中均未检出，而在CK组中含量最高。

在所检测的游离氨基酸中，赖氨酸的数量最高，含量由高到低依次为S组>L处理组>CK处理组>C处理组>Y处理组；其次含量较高的主要有丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等，这些氨基酸作为鱼酱鲜味的有效成分，对鱼酱的风味有重要的影响。

5 总结

从游离氨基酸的含量和种类来分析，接菌发酵的河鲀发酵鱼酱要优于空白发酵的河鲀鱼酱；单一菌种发酵的河鲀鱼酱不如复合发酵。

谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等作为河鲀发酵鱼酱呈鲜成分的主要氨基酸，而赖氨酸对鱼酱的鲜味也有很大贡献。