三维细胞培养技术在胶质瘤细胞培养中的应用研究*

王兰林 综述，戚仁莉，余化霖 审校

(昆明医科大学第一附属医院微创神经外科，云南 昆明 650000)

胶质瘤是中枢神经系统中最常见恶性肿瘤。在成人致死性脑肿瘤中，高级别胶质瘤最多，其生长迅速、细胞丰富、有明显的色差和多形性，即使确诊后积极治疗，包括手术最大限度切除病灶、术后放化疗等综合治疗措施，疗效仍不尽人意。胶质瘤患者平均生存时间仅为12～14个月，长期存活比例很低(<5%)[1]，其原因是胶质瘤细胞呈侵袭性生长及生物学特征异质性导致。科学家们为此进行了大量基础与临床研究，而细胞培养技术是基础研究的基础。

二维细胞培养技术成熟，具有经济、操作简便等优点，一直以来是肿瘤生物学研究体外实验的重要方法，但也存在不能反映肿瘤体内真实生长情况等不足。自20世纪中期有人提出三维细胞培养(3DCC)这一概念以来，经过数十年发展，三维体外模型弥补了二维细胞培养与整个动物系统之间的空白。通过模仿体内环境特征，三维模型为干细胞的行为、发育中的组织和器官及肿瘤的行为提供了独特视角，有助于加速癌症生物学和组织工程学的转化研究。

1 3DCC概念

3DCC是指将具有三维结构的不同材料载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞与周围环境中的细胞外基质(ECM)、各种细胞因子、化学因子、物理因子及其他细胞发生交流与相互作用，进而在三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物[2]。相比于二维细胞培养技术，3DCC既可模拟细胞体内生长的微环境，还同时具有体外细胞实验的直观性和条件可控性等优势。3DCC因体外模型与肿瘤体内生长环境具有相似的形态学和细胞生物学特性，现已广泛应用于肿瘤学研究。

三维培养胶质瘤细胞在形态学、增殖速度、细胞周期等方面与二维培养细胞有明显差异,并且具有类似体内高级别胶质瘤的免疫组化特点,三维胶原复合支架能更好地模拟体内胶质瘤生长的微环境,可作为胶质瘤体外模型，并用于多种研究[3]。与现有的源自患者的细胞培养方法相比，胶质母细胞瘤(GBM)的三维培养支架提供了更好的生理表现和异种移植模型[4]。

2 3DCC在胶质瘤细胞培养中的应用

2.1抗肿瘤药物耐药性或新的抗肿瘤药物筛选方面 传统的体外研究方法是将细胞培养为单层细胞或神经球细胞(富含癌症干细胞的细胞簇)，但这两种方法都不能准确反映GBM三维化学耐受微环境的复杂性。三维微肿瘤是一种多功能的高通量模型系统，比传统方法更能在体内复制肿瘤生物学[5]。使用三维细胞模型评价药物的耐药性有利于得到更加准确的结果，从而为体内实验提供更可靠的参考[6]。MUSAH-EROJE等[7]研究发现，与二维细胞培养技术相比，三维培养细胞对替莫唑胺的耐药性更强，而缺氧则增强了这种耐药。研究结果表明，微环境因素影响GBM对替莫唑胺的敏感性。因此，了解三维模型中涉及替莫唑胺耐药的机制可能有助于确定新的策略，从而更有效地使用现有的药物标准。有学者提出了一种新颖的三维水凝胶平台VersaGel，其可以使患者或患者衍生的异种移植物模型在离体组织中生长，并在临床相关的时间范围内评估对批准的疗法(如替莫唑胺)的敏感性，这在转化研究和个性化医学中将非常有用[8]。

KAPHLE等[9]研究指出，在二维或三维培养环境中，药理分子对肿瘤细胞运动的作用不同。也有学者建立了用于三维胶质瘤细胞培养的胶原支架，在这些三维支架上培养的胶质瘤细胞比二维培养细胞表现出更大程度的去分化和静止。三维培养细胞对化疗药物烷基化剂的耐受性也增强了，使胶质瘤干细胞的比例大大增加，并且上调O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶。而且，三维培养肿瘤细胞显示出与胶质瘤患者相似的化疗耐药模式。这表明三维胶原支架在体外筛选新的抗胶质瘤药物的研究平台是有希望的[10]。MA等[11]建立了三维体外肿瘤模型，并证明其是了解GBM内在本质的有力工具，可以被视为潜在的药物筛选平台。KESSEL等[12]开发了实时动态半胱氨酸蛋白酶3/7凋亡和碘化丙啶三维多细胞肿瘤球活性测定，这两种方法均可用于二级筛选，以更好地了解从一级筛选中识别出的这些潜在候选药物的作用机制，从而可以鉴定出更合格的候选药物并简化药物的发现过程、研究与开发。BERNARDO等[13]利用3DCC筛选出LQB-118。该药物是用于GBM单药治疗并与放疗或顺铂相关的有希望的药物，其作用与抑制GBM相关的生存信号通路有关。

2.2肿瘤血管生成方面 近年来，抗血管生成疗法一直是神经肿瘤学的主要研究重点和热点。血管生成在肿瘤生长和存活中起重要作用，为抗癌治疗提供了靶标。GBM是最具侵袭性和血管化的肿瘤之一，贝伐单抗被认为是使GBM患者受益最多的抗血管生成药物。到目前为止，没有一种药物能超过贝伐单抗的治疗益处。此外，抗血管生成药物的抗渗透作用可以显著减少肿瘤相关的水肿，从而能够稳定或改善患者神经功能和生活质量。特别是，抗血管生成剂可显著延长患者无进展生存期[14]。KO等[15]介绍了一种注塑成型的塑料阵列三维球体培养平台，其可用于研究肿瘤球体诱导的血管生成模型，有潜力提供与血管化癌症研究相关的强大且可重复的体外测定。这个易于使用、随时可用的平台可以转化为增强的临床前模型，可以忠实地反映复杂的肿瘤微环境。

有学者利用3DCC模拟体内血管生成的三维空间，真实有效地评估各因素对血管生成的影响。该研究以胶质瘤球体和纤维蛋白凝胶中的人类脐静脉内皮细胞作为肿瘤模型，观察阿托伐他汀对GBM细胞的抗血管生成和凋亡活性，结果发现，这种具有纤维蛋白的仿生模型可以提供广泛适用的三维细胞培养系统，以研究阿托伐他汀等抗癌药对体内和体外肿瘤恶性的影响，并且阿托伐他汀可以用作GBM的治疗药物[16]。

2.3胶质瘤细胞基因表达和生物学功能方面 目前，3DCC已越来越多地用于研究肿瘤细胞生物学，以改进对自然发育环境的模拟。STOCZYNSKA-FIDELUS等[17]结合免疫细胞化学、酶细胞化学、5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法和实时显微镜观察异柠檬酸脱氢酶1(IDH1) R132H突变的8种胶质瘤细胞培养物中的衰老特征，结果发现，3DCC可延长肿瘤IDH1 R132H阳性细胞的存活，但是并不能提高稳定效率。提示胶质瘤细胞的衰老是在体外自动触发的，为基于这种现象的潜在新治疗策略提供了机会。

有研究使用具有不同大小空隙的三维胶原蛋白支架与传统二维细胞培养,用于基因表达谱的比较和相关的神经胶质瘤细胞的生理功能研究，包括U87 U251 HS683细胞系。该研究结果显示，三维胶原支架培养可上调与干性、细胞周期、凋亡、上皮-间充质转化、迁移、侵袭和胶质瘤恶性相关基因的表达，并诱导相应的功能改变；胶原支架的孔径大小似乎不影响胶质瘤细胞的基因表达或功能。提示三维胶原支架增强了胶质瘤细胞的恶性程度，可作为胶质瘤研究的体外研究平台[18]。

与二维细胞培养技术相比，三维培养肿瘤细胞显示出对细胞毒性T细胞介导的免疫反应的抵抗力增强。然而，三维培养肿瘤细胞是否具有增强的对NK细胞毒性的抗性，目前尚不清楚。有研究者通过比较蛋白质组学在二维培养和三维培养的U251细胞之间的363个差异表达蛋白，并通过生物学信息构建了基于这些差异蛋白的免疫相关蛋白-蛋白相互作用网络，结果显示，三维培养细胞中人类白细胞抗原-E的上调可能导致肿瘤对NK细胞介导的免疫反应的抵抗力增强[19]。

GBM的侵袭和迁移、渗透到非肿瘤脑实质是导致目前治疗困难的关键生物学行为。而HUANG等[20]应用三维水凝胶模型研究发现，Rac1和RhoA信号的联合抑制将是抑制GBM入侵的有前途的策略，为GBM的侵袭和迁移研究提供了方向。DIAO等[21]的研究在微型三维模型中培养了4种类型的典型GBM细胞系(LN229、SNB19、U87、U251),结果显示，GBM细胞在细胞形态、增殖、迁移和侵袭方面显示出特定的特性，其中一些很少见。此外，该研究详细观察了细胞如何侵入周围的ECM及相应的特定侵袭模式。提示这4种类型的细胞在其癌症发展过程中具有不同特征。如果将这种复杂的体外模型应用于患者衍生的细胞，则具有成为临床相关预测模型的潜力。

2.4肿瘤细胞对辐射敏感性方面 放射治疗已成为高级别胶质瘤术后常规治疗手段，其利用高能射线(X线、重粒子等)破坏肿瘤细胞DNA双链结构，杀伤、杀死肿瘤细胞[22]。放射治疗是否有效取决于胶质瘤细胞对射线的敏感性，CARAGHER等[23]总结和分析了3DCC系统的发展，并特别关注了其如何加强化合物的设计和识别，从而提高放疗的疗效。JIGUET-JIGLAIRE等[24]对U87-MG GBM细胞和人GBM的7种原代细胞培养物进行放疗和化疗，结果显示，三维水凝胶保留了原始的癌症生长行为，并能够评估恶性神经胶质瘤对放射线和药物的敏感性，以反映治疗反应的肿瘤间异质性。因此，该方法可以用于新疗法的临床前评估。

CHIBLAK等[25]研究了不同CD133状态的胶质瘤干细胞在光子、质子和碳照射后的三维模型中的辐射敏感性，结果发现，碳辐照在消除胶质瘤干细胞中是有效的，其相对生物学效应范围大约为2～3。该研究数据强烈建议使用经典的放射生物学端点进一步探索胶质瘤干细胞。GOMEZ-ROMAN[26]等建立的GBM三维模型能够可靠地预测临床疗效，在GBM药物放射联合治疗的临床前评估中的具有潜在价值。随后从3DCC模型中获得的数据确定了GBM中DNA修复和放射敏感性的新决定因素和机制，以及血管内皮生长因子/蛋白激酶B(Akt)信号传导通过调节非同源末端连接与同源重组介导的DNA修复之间的平衡来影响放射敏感性的新作用，并确认Akt是有希望的治疗靶标[27]。

2.5胶质瘤干细胞方面 目前缺乏支持临床侵袭性的GBM干细胞生长的体外模型，阻碍了针对GBM的新型有效疗法的开发。虽然原位癌患者来源的GBM异种移植模型可以最好地反映体内肿瘤行为，但建立异种移植耗时、昂贵且成功率较低。为了解决这些限制，合成了由多壳聚糖和透明质酸组成的三维多孔支架，并直接从生长在支架上或附着单层细胞的新鲜异种植物中获取GBM干细胞，对其细胞表型生长、表达进行比较。虽然二维贴壁培养物为扁平上皮细胞的单层生长，但GBM细胞以自黏卵形细胞簇的形式在透明质酸支架孔内增殖。支架上的生长伴随着基因的更高表达，这些基因介导上皮-间质转化并维持原始的、未分化的表型，这是肿瘤干细胞的标志。支架生长的细胞还显示出更高的基因表达，这些基因促进了对低氧诱导的氧化应激的抗性。与贴壁细胞相比，支架生长的细胞对临床利用的烷基化剂表现出明显的抗性。提示三维透明质酸支架能更好地模仿体内生物学和临床行为，并为开发新型的个性化治疗提供了依据[28]。WANG等[29]将神经胶质瘤细胞系与三维透明质酸支架一起培养，以探索神经胶质瘤干细胞样细胞富集的可能性，结果显示，三维透明质酸支架具有更好的富集胶质瘤干细胞样细胞的能力，可以作为一种简单有效的体外培养和富集肿瘤干细胞的方法，以支持肿瘤干细胞生物学研究和新型抗癌疗法的发展。

3 小 结

3DCC作为一项新技术，近年来在肿瘤研究领域成为热门话题，但其仍存在很多不足，有待进一步改善和发展。一方面，3DCC费用高、对操作技术要求高、操作过程较复杂、用时长；另一方面，培养环境与人体真实状态存在差异，尚不能完全模拟体内环境，而且由于模型中心缺乏营养或供氧，细胞无法无限生长。随着3DCC技术与材料学、生命科学等技术的交叉融合和不断发展，这些不足都会逐步解决，其在肿瘤领域的研究具有广阔的前景和价值。相信随着3DCC的发展，新的时期、新的领域将会产生新的研究成果，使胶质瘤的治疗迈上新的台阶，最终造福广大患者。