产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株筛选、鉴定与酶学性质的初步研究

陶大炜，宁喜斌,2,3,4*

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)3(农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估试验室(上海)，上海，201306)4(国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海)，上海，201306)

环糊精 (cyclodextrin，CD)通常由6个以上D-吡喃葡萄糖基通过α-1,4-糖苷键相连而成的，由于葡萄糖基个数的不同，又被分为α-CD、β-CD和γ-CD这3种，它们是应用最广泛的环糊精，也称基础环糊精，其中α-CD有6个葡萄糖基，β-CD有7个，而γ-CD有8个[1]。环糊精分子结构的外面部分具有亲水的特点，因为含有亲水基团，分子结构的内部相对就是疏水的，正因为其分子结构特殊，从而可以包络不同化合物，以改变它们物理和化学等性质，因此环糊精可以被广泛并且有效的利用，并运用于如食品工业、化妆品、药品、环保、化学分析与检测等诸多领域里[2-5]。

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)可作用于淀粉等，使底物的葡萄糖基团发生转移，从而获得环糊精。CGTase可以催化4种不同的反应：歧化反应、环化反应、偶合反应和水解反应(其中前3种为3种转糖基反应)[6]。在工业应用中，主要是利用CGTase的环化反应作用，与淀粉等发生反应后生产环糊精。

目前大致可归纳为筛选产酶野生菌株进行发酵生产、结合基因库对产酶菌株的基因进行克隆表达、使用蛋白质工程技术对已知的基因片段进行改良这3种方法获取CGTase，其中产酶野生菌株的筛选是直接有效的，同时也是其他方法的基础[7]。在自然界中有很多菌株可生产CGTase，它们的分布很广泛，既存在于火山、沙石、温泉、油井等[8-11]环境，还存在于富含淀粉土壤的玉米、薯类、土豆、南瓜、甘蔗等[12]的种植地，同时这些野生菌株的种类众多。

国内外学者主要致力于筛选高产且性质稳定的野生菌株、提高酶的热稳定性及pH稳定性、优化菌株的产酶条件提高酶活性、物理化学诱变与在工程菌株中的异源表达提高酶活性等。MARTINS等[8]筛选出的包含黏琼脂芽孢杆菌(Bacillusagaradhaerens)所产CGTase酶活性较低，仅有0.31 U/mL，需要通过产酶条件优化等方式提高其酶活性。COELHOSL等[12]筛选出的芽孢杆菌(Bacillussp.)产β-CGTase的热稳定性较差，限制了其在工业上的应用能力。张佳瑜等[13]将来自于浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)的产α-CGTase酶的基因进行克隆，并优化产酶条件，酶活性从1.9 U/mL提高到4.5 U/mL，说明基因的克隆表达和产酶条件优化有助于提高酶活性。雷新辉[5]筛选出的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)产α-CGTase酶活性为0.64 U/mL，经复合诱变处理后，活性提高到5.68 U/mL，说明诱变育种对于菌株的产酶活性有很大影响。

为了使环糊精的工业化生产能够实现，同时降低成本，找到产酶活性高、稳定性良好的野生菌株是关键。本试验从上海浦东新区新场镇某农场马铃薯、红薯、玉米种植田分离、筛选产α-CGTase的菌株，对其中1株酶活性较高的菌株进行形态学特征、生理生化试验鉴定和16S rRNA序列比对分析，对其酶学性质进行了初步研究，以期为进一步工业化开发利用性状稳定且高产α-CGTase的菌株提供借鉴，旨在为工业生产α-CGTase及其应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源

2019年8月于上海浦东新区新场镇某农场马铃薯、红薯、玉米种植田(121.658 766 °E，31.052 923 °N)采集样品，用无菌采样器采集3～10 cm深的土壤样品，样品采集后放入无菌取样袋，并在2 h内送回试验室进行处理分析。

1.1.2 试剂

PCR扩增试剂盒、酵母浸粉、DNA提取试剂盒、可溶性淀粉、蛋白胨等, 上海生工生物工程股份有限公司；α-CD, Sigma(上海)公司；NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O,国药集团化学试剂有限公司；Na2CO3，上海柯灵斯试剂有限公司；酚酞、甲基橙，上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 培养基

初筛培养基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母浸粉5，琼脂15，NaCl 5，Na2CO31，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，酚酞 0.3，甲基橙 1，自然pH，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min。

复筛培养基(g/L)：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母浸粉5，NaCl 1，Na2CO30.5，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.0，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min。

发酵培养基及种子培养基，同复筛培养基。

1.2 仪器与设备

UV-1800PC紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏净集团安泰公司；THZ-300C恒温培养摇床、GHP-9 270隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HWT-6B恒温水浴箱，天津市恒奥科技发展有限公司；CX41RF显微镜，东京奥林匹斯公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；PTC-200 PCR仪、GelDoc XR凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 产α-CGTase菌株的初筛

分别取土豆、红薯、玉米种植田土样10 g加入到90 mL含玻璃珠的无菌水中，充分振荡40 min。取1 mL 上述混合液加入99 mL营养肉汤，37 ℃，170 r/min条件富集培养24 h。使用生理盐水进行梯度稀释，并将稀释液(100 μL)均匀涂布于初筛培养基，37 ℃培养48 h。以出现黄色透明圈作为筛选标准，将筛选出的菌株分离纯化，4 ℃条件下进行保藏。

1.3.2 产α-CGTase菌株的复筛

粗酶液的制备：发酵培养基装液量100 mL/250 mL，菌种接种量为4%的种子培养基，37 ℃、170 r/min摇床培养48 h，于10 000 r/min离心10 min后所得上清液即为粗酶液。

α-CGTase活力的测定：采用甲基橙褪色法测定酶的环化活力。在酸性(pH 1.1～1.4)条件下，α-CD与甲基橙发生反应，形成络合物，使溶液的吸光度下降。在一定范围内，吸光度的下降与α-CD的浓度存在着线性关系[4,14]。用50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.0)配制40 g/L的可溶性淀粉溶液做底物，取0.9 mL于试管中，加入适当稀释的粗酶液0.1 mL，均匀混合。50 ℃水浴反应10 min，加入1 mol/L盐酸溶液1 mL中止反应。再加入0.1 mmol/L 甲基橙溶液1 mL，于20 ℃静置15 min， 507 nm测定吸光度[15]。对应α-CD标准曲线计算浓度，1个酶活单位(U)定义为上述条件下1 min生成1 μmol α-CD所需的酶量。

1.4 菌种鉴定

1.4.1 形态学鉴定

观察纯化后菌株的菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态。

1.4.2 生理生化鉴定

根据相关文献[16-17]，对菌株进行生理生化鉴定试验，主要包括水解淀粉试验、吲哚试验、硝酸盐还原、接触酶、分解酪氨酸、甘露醇、葡萄糖产酸产气、阿拉伯糖、棉籽糖利用等。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析和构建系统发育树

根据细菌总DNA提取试剂盒说明提取菌株DNA。PCR扩增采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR扩增产物送至上海生工生物公司测序，登入NCBI(National Center for Biotechnology Information)，BLAST比对测序结果，获取同源性高的菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA-X软件中的邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，并对其分析鉴定[18]。通过Bankit将菌株鉴定的16S rRNA基因的部分序列向GenBank申请登录号(GenBank Accession)。

1.5 酶学性质初步研究

1.5.1 酶的最适作用温度

用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.0)稀释粗酶液和甲基橙溶液，设定20、30、40、45、50、55、60、70、80 ℃，9个反应温度。按照上述不同反应温度的条件，对各反应温度条件下的样品分别测定其α-CGTase活性，将酶活性最高者定义为100%，并计算相对酶活性。

1.5.2 酶的热稳定性

取适量无菌粗酶液分装于离心管，分别在40、45、50、55、60 ℃，5个保温温度条件下分别保温不同时间。按照上述不同保温温度和时间的条件，对各保温条件下的样品分别在不同保温时间下分别测定其α-CGTase活性，将未进行保温处理的酶活性定义为100%，并计算相对酶活性。

1.5.3 酶的最适作用pH

分别配制浓度为50 mmol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0～5.0)、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.0～8.0)、甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.0～10.0)，Na2HPO4-NaOH缓冲液(pH 11.0～12.0)[15]。设定pH 3.0～12.0，10个反应pH。按照上述不同反应pH的条件，对各反应pH条件下的样品分别测定其α-CGTase活性，将酶活性最高者定义为100%，并计算相对酶活性。

1.5.4 酶的pH稳定性

先将粗酶液与不同pH值(3.0～12.0)的缓冲液混合，放置处理1、2 h。按照上述不同反应pH和处理时间的条件，对各pH处理条件下的样品分别在1、2 h下分别测定其α-CGTase活性，将未经过不同pH缓冲液处理的酶活性定义为100%，并计算相对酶活性。

1.5.5 金属离子对酶活力的影响

配制浓度为1 mmol/L的不同金属离子(K+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Co2+)溶液，分别取适量与粗酶液混匀。对添加不同金属离子的样品分别测定其α-CGTase活力，将未添加金属离子的酶液作为对照组，定义其酶活力为100%，并计算各组相对酶活力。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

初筛培养基因加入酚酞而呈红色，菌株所产α-CGTase可降解培养基中的可溶性淀粉形成环糊精，环糊精可包埋酚酞，使菌株周围呈现黄色透明圈，透明圈越大，说明菌株产α-CGTase越多[19]。据此从土壤中筛选出117株产α-CGTase的菌株，从中挑选出透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株30株进行发酵产酶培养复筛，通过甲基橙褪色法分别测定酶活性，获得酶活性较高(表1)菌株TLLY7。本试验将菌株TLLY7作为出发菌株，进行后续试验，其酶性活为1.35 U/mL，这与其他学者筛选出的野生菌株的酶活性相似，例如陈龙然[4]筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)产α-CGTase的酶活性(0.95 U/mL)、陈龙军等[20]筛选出的嗜热芽胞杆菌(Gebacilliussp.)产α-CGTase的酶活性(0.66 U/mL)、叶学军[21]筛选出的地芽孢杆菌(Geobacilluscaldoxylosilyticus)产α-CGTase的酶活性(1.29 U/mL)，低于他们进行复合诱变、产酶条件优化和基因的克隆与表达等方法后的酶活性，分别为2.28、5.3和6.18 U/mL，这说明筛选出活性高的野生菌株只是完成了第1步，只依靠野生菌株发酵有很大的局限性，需要结合其他方法提高酶活性，才有更大的工业应用潜力。

表1 产α-CGTase部分菌株的筛选结果Table 1 Screening results of α-CGTase producing strains

2.2 菌种鉴定

2.2.1 菌种的形态观察

菌株TLLY7为革兰氏阳性，菌体成杆状，有芽孢产生。图1-a为菌株TLLY7在初筛培养基上的菌落透明圈形态。图1-b为菌株TLLY7平板菌落形态，菌落呈黄白色，圆形隆起，不光滑，不透明，大小2～5 mm，有褶皱，边缘整齐。图1-c为菌株TLLY7经革兰氏染色后在油镜下的观察图。

a-初筛培养基菌落透明圈形态；b-平板菌落形态；c-细胞显微形态图1 菌株 TLLY7 菌落形态和在油镜下的细胞形态Fig.1 The colony morphology and cell morphology under oil immersion lens of strain TLLY7

2.2.2 生理生化鉴定

根据相关文献[16-17]，对菌株TLLY7进行生理生化鉴定。表2为菌株TLLY7的生理生化鉴定结果。

表2 菌株TLLY7的生理生化特征Table 2 Biochemical characteristics of strain TLLY7

2.2.3 16S rRNA鉴定及系统发育树构建

图2为菌株TLLY7的PCR产物电泳条带图。由图2可知菌株TLLY7经PCR扩增后，条带约1 500 bp，扩增产物经测序得到的16S rRNA序列为1 480 bp，登录NCBI官网上传序列并进行BLAST比对，结果显示高于Ident值96%的菌株有100多株，说明较多菌株与菌株TLLY7序列相似，将它们序列下载后通过MEGA-X的NJ法构建系统发育树(图3)[18, 22]。由图3可发现菌株TLLY7和P.maceransNBRC 15 307T(NR 112729.1)在同一分支上，其相似性高达98.91%，说明两者同为类芽孢杆菌属，且Bootstrap检验值为100，说明发育树所表示的2种菌株之间的进化关系可信[23]。结合形态学、生理生化鉴定可确定菌株TLLY7为浸麻类芽孢杆菌(P.macerans)。将菌株TLLY7的核酸序列通过Bankit向GenBank申请的登录号为MT 705866。

图3 基于16S rRNA序列分析的菌株TLLY7的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain TLLY7 based on 16S rRNA sequence analysis

2.3 菌株TLLY7酶学性质初步研究

2.3.1 α-CD标准曲线的绘制

根据标准方法绘制α-CD标准曲线。线性回归方程为y=0.546 1x-0.000 8，R2=0.999 1，表明线性良好。

2.3.2 酶的最适作用温度

图4为温度对TLLY7所产α-CGTase活性的影响。当反应温度在20～50 ℃，酶活性不断升高，从30 ℃开始酶活性升高的很快。温度高于50 ℃，酶活性开始下降。尤其是温度高于60 ℃后，酶活性下降的很快，在80 ℃时酶活性仅15%。温度在40～60 ℃，酶活性保持在80%以上。所以酶的最适作用温度为50 ℃，是中温酶。该酶的最适反应温度低于张晓磊[19]从黄海海域中筛选出的包含黏琼脂芽孢杆菌所产α-CGTase的最适反应温度(55 ℃)，低于张昌志[24]从罗汉果中筛选出的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)所产β-CGTase的最适反应温度(60 ℃)，具有节约工业应用的能源，提高发酵效率的潜力。

图4 温度对TLLY7所产α-CGTase活力的影响Fig.4 Effects of temperature on the α-CGTase produced by TLLY7

2.3.3 酶的热稳定性

图5为温度对TLLY7所产α-CGTase热稳定性的影响。在40 ℃下保温2 h酶活性保留82%，保温6 h保留30%的酶活性。在45 ℃保温1 h酶活性保留90%，保温5 h保留30 %酶活性。在50 ℃保温1.5 h，酶活性保留50%。在55 ℃保温0.75 h酶活性丧失50%。在60 ℃保温1 h酶活性保留28%。陈龙然[4]从淀粉厂泥土中筛选出的地衣芽孢杆菌所产α-CGTase在60 ℃保温1 h酶活性保留17%。本试验所产α-CGTase热稳定性相对较好，但热稳定性仍需要提高。因为酶的热稳定性不足会限制酶的工业化应用，所以还需要进行试验提高酶的热稳定性。

图5 温度对TLLY7所产α-CGTase稳定性的影响Fig.5 Effects of temperature on the stability of α-CGTase produced by TLLY7

2.3.4 酶的最适作用pH

图6为pH对TLLY7所产α-CGTase的影响。pH 3.0～4.0，酶活力很低。pH 4.0～6.0，酶活性升高的很快。pH>6.0，酶活性不断下降。pH 12.0时，酶活性仅5%。表明本试验所产α-CGTase的最适作用pH值为6.0，是弱酸性酶。

图6 pH对TLLY7所产α-CGTase活力的影响Fig.6 Effects of pH on the α-CGTase produced by TLLY7

2.3.5 酶的pH稳定性

图7为pH对TLLY7所产α-CGTase稳定性的影响。在pH 6.0～8.0，处理1 h酶活性保留95%以上，处理2 h酶活性保留90%以上。pH值<6.0或>8.0，酶活性明显下降。pH 3.0和12.0处理1 h分别保留9%和11%酶活性，处理2 h酶几乎失活。该酶在pH 10.0处理1 h保留77%酶活性。曹冬梅[25]从长白山温泉泥土中筛选出的高温芽孢杆菌所产β-CGTase在pH 10.0处理1 h保留60%酶活性。本试验的pH稳定性相对较好，具有更宽pH范围的应用前景。

图7 pH对TLLY7所产α-CGTase稳定性的影响Fig.7 Effects of pH on the stability of α-CGTase produced by TLLY7

2.3.6 金属离子对酶活的影响

由图8可知，对酶有不同程度的促进作用的是Zn2+、Mn2+和Ca2+，而对酶的促进作用最强的是Ca2+，相对酶活性约为空白对照的1.25倍。对酶有不同程度的抑制作用的是Cu2+、Fe2+和Co2+，其中对酶的抑制作用最强的是Cu2+，酶活性被抑制33%左右，可能由于离子结合蛋白的作用区域而抑制酶活。K+、Mg2+对酶活力的影响不是很明显。这与国内外学者筛选的菌株所产α-CGTase的性质相似，具有参考意义[26-27]。

图8 金属离子对α-CGTase活力的影响Fig.8 Effects of metal ions on the α-CGTase activity

3 结论与讨论

本试验利用甲基橙-酚酞平板法和甲基橙褪色法从上海浦东新区新场镇某农场土豆、红薯、玉米种植田分离出1株高产α-CGTase的菌株TLLY7，16S rRNA测序分析其基因序列，经BLAST比对后构建系统发育树，结合形态学特征、生理生化鉴定后确定该菌株为浸麻类芽孢杆菌，命名为P.maceransTLLY7。将菌株TLLY7的核酸序列通过Bankit向GenBank申请的登录号为MT 705866。

菌株TLLY7产α-CGTase的酶活性为1.35 U/mL，酶学性质的初步研究表明，50 ℃、pH 6.0为该酶的最适反应条件，为弱酸性中温酶。该酶在40～45 ℃保温1 h保留90%以上的酶活性，在60 ℃保温1 h保留27%酶活性，pH 6.0～9.0处理1 h保留95%以上的酶活性，处理2 h保留90%以上的酶活性，热稳定性和pH稳定性较好。Zn2+、Mn2+和Ca2+对酶有促进作用，Cu2+、Fe2+和Co2+对酶有抑制作用。其中Ca2+对酶的促进作用最强，Cu2+对酶的抑制作用最强。K+、Mg2+对酶活性的影响作用较小。

由于环糊精具有特殊的分子结构，可以包络不同化合物，改变它们理化性质，目前被应用到了多个领域，例如在食品领域中可以达到抗氧化、保护色素等效果，使使提高食品的贮藏时间、改善食品的保存；在医药领域中可以改变药物的性质使得药物刺激减少、提高药物的稳定性和降低毒副作用等效果，使药品更能被人们接受，还可被应用于化妆品、环保、化学分析与检测等诸多领域，因此对CGTase的产酶菌株进行分离纯化和酶学性质的研究是很有意义的[5]。本试验筛选出的产α-CGTase野生菌株可为未来的工作奠定基础，也为酶的分离纯化与工业化应用提供了依据。