牛蒡多糖的提取及生物活性研究进展

张晓晓，柴智，冯进，崔莉，李春阳，李莹*，黄午阳*

1(江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京，210014)2(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江，212013)

牛蒡(ArctiumlappaL.)为菊科牛蒡属二年生草本植物，俗称“东洋参”，有“蔬菜之王”的美誉。牛蒡富含膳食纤维，且胡萝卜素含量比胡萝卜高150倍，是天然的营养保健佳品。牛蒡中具有糖类、多酚类、黄酮类及挥发油等生物活性物质，多糖是其中重要的一种[1]。牛蒡多糖的提取方法主要有：热水浸提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法、碱液提取法等，经提取获得的粗提物中一般还含有蛋白质、色素和一些小分子杂质，需进一步脱除得到较纯组分以便后续结构表征和活性研究[2-3]。国内外学者在牛蒡多糖(A.lappaL.polysaccharides, ALPs)的生物活性方面做了大量工作，许多报道表明牛蒡多糖具有抗炎、调节肠道菌群、调节脂质代谢及抗氧化等多种生理活性。本文对近年来牛蒡多糖的提取纯化、结构表征及其生物活性研究成果进行总结，旨在为进一步探究牛蒡多糖的生物活性机制及应用提供参考。

1 牛蒡多糖的提取、纯化及结构表征

1.1 提取方法

牛蒡多糖的提取方法，目前研究中多采用热水浸提、酶解提取、碱液提取及基于水提的新型辅助提取方法，如超声辅助和微波辅助等(见表1)。

1.1.1 热水浸提法

热水浸提法是多糖提取的经典方法，利用“相似相溶”的原理，将极性大分子化合物多糖溶于水等极性溶剂来进行提取[4]。提取工艺流程大体如下：牛蒡粉→热浸提→浓缩→醇沉→干燥→粗多糖→溶解→除杂→精多糖。目前研究中所采用的热水提取法或是在热浸提之前做脱脂处理，或是改变提取条件(如料水比、提取温度、提取时间等)，或是采用不同的除杂方式，以此得到精多糖组分。袁平川[5]采用热水浸提法提取牛蒡中的多糖，研究了不同提取条件对多糖得率的影响，得出在料液比为1∶25、温度为80 ℃条件下提取90 min得率最高，为67.54%。WANG等[6-7]同样采用热水浸提法提取牛蒡多糖，首先用体积分数为95%的乙醇对牛蒡粉做脱脂处理，然后于80 ℃热水中提取2 h，经大孔树脂脱色、Sevag法脱蛋白后得到粗多糖组分，经二乙氨基乙基(diethyl aminoethyl, DEAE)-52纤维素柱、SephadexG-100凝胶柱除杂分离后得精多糖组分，得率为4.4%。由于热水浸提法耗时较长，且高温长时间提取可能会使活性降低，所以近年来多采用基于热水浸提的新型辅助提取技术。

1.1.2 超声辅助提取法

超声辅助提取法是利用超声波产生强烈的空化效应、机械效应等来破坏植物的细胞膜，使生物活性物质更易提出[8-9]。JIANG等[10]选用超声辅助提取法探究牛蒡多糖的提取工艺，结果显示，在一定范围内，液料比、超声功率、提取温度及时间对牛蒡粗多糖的提取率都有一定的促进作用。胡建[11]发现料液比对牛蒡多糖的提取得率影响最大，超声时间次之，最佳工艺条件为：料液比1∶15、超声时间15 min、乙醇体积分数80%。罗巅辉[9]采用均匀设计法对超声波提取牛蒡多糖工艺进行优化，最佳条件为：料液比1∶35、超声波提取功率700 W、超声波时间102 min，牛蒡多糖的得率可达59.5%。与常规水提法相比，超声辅助提取法节能省时、加速多相扩散、对多糖结构和分子性质的损伤较小，但是超声设备规模小、功率强度受制约噪音大、设备稳定性不高、有效作用范围局限，因此不能满足大规模生产[12]。

1.1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法是基于微波穿透能力强的特点，利用微波的高能量及在微波场中物质吸收微波能力的差异，破坏植物的细胞组织，选择性溶出某些组分从而达到快速提取的效果[13]。唐仕荣等[14]运用常压和高压两种微波辅助法提取牛蒡多糖，按正交试验得出的最佳料液比、处理时间、压力及微波功率提取牛蒡多糖，常压和高压微波辅助法所得提取率分别为28.84%和31.97%。杨萍等[13]采用正交试验优化微波辅助提取牛蒡多糖工艺，最优条件为：料液比1∶40、微波功率300 W、提取时间2 min，多糖提取率为13.41%。微波辅助提取法具有简单、省时、高效等优点[15]，但提取功率太高或时间过久可能会造成多糖的结构变化，影响多糖的溶出，降低多糖得率。

1.1.4 双水相萃取法

双水相萃取法是基于双水相体系中生物物质的选择性分配来提取多糖。此法生物适应性广泛，已用于其他多糖的提取[16]，对于牛蒡多糖的提取鲜有报道。巫永华等[17]用超声辅助双水相提取牛蒡多糖，试验建立(NH4)2SO4/PEG双水相体系，在料液比0.04 g/mL、温度为49 ℃条件下浸提2.6 h，而后超声处理31 min，牛蒡多糖的得率达到(32.35±0.85)%。相比于其他方式，超声波辅助双水相法的提取率和多糖含量最高，具有操作条件温和、有机溶剂残留少等优点。

1.1.5 酶解法

酶解法利用酶反应的高度专一性，选择相应的酶水解或降解细胞壁，使胞内有效成分提取出来。高明侠、吕兆启课题组探究了酶法提取多糖工艺[18-20]：从8种不同单酶中选择出多糖得率最好的木瓜蛋白酶和植物水解蛋白酶[18]；由正交试验得出双酶法提取牛蒡多糖的最佳条件：植物水解蛋白酶和木瓜蛋白酶浓度各为牛蒡质量的2%、pH 8.0、酶解温度45 ℃、酶解反应时间4 h、料液比1∶15，提取的最高得率为12.40%[19]；也采用过壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的提取方法[20]，但相比之下，双酶法提取牛蒡多糖得率更高。宋慧等[21]采用复合酶法提取牛蒡多糖，在纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶用量分别为2.5%、1%、3%，温度为 50 ℃，时间为70 min，pH为5.0时提取量最高，平均得率为9.44%，比单酶处理得率高13.11%；且木瓜蛋白酶对多糖含量的影响最为显著。酶解法具有专一性高、绿色环保、条件温和、对多糖结构破坏性小等优点，可避免改变多糖生物活性，提高多糖得率。

1.1.6 碱液提取法

碱液提取法是在稀碱的作用下，植物的细胞、细胞壁吸水膨胀破裂，使其中游离的多糖进一步溶解而被提取出来。周浓等[22]采用碱液提取法提取牛蒡多糖，通过单因素试验和正交试验确定最佳条件为：料液比1∶30、NaOH浓度0.06 mol/L、提取温度80 ℃、提取时间1 h，得率为7.21%。ZHANG等[23]选择0.5 mol/L的NaOH溶液提取牛蒡多糖，除杂分离后经表征推测其主骨架可能为阿拉伯糖，与水提法所得的由果糖主链和葡萄糖支链构成的多糖结构有很大不同。研究显示碱液提取法所得多糖在体内外均表现出较好的生物活性[23]，但此法对材料有选择性，且易破坏多糖结构，需严格控制酸碱浓度。

1.1.7 其他提取方法

除以上提取方式外，回流提取法[24]也应用于牛蒡多糖的提取。由于牛蒡的品种不同，其多糖的含量可能会有差异。为节省资源提高得率，现多采用超声结合酶法[25]、超声-微波协同提取[26]等多法联用方式提取牛蒡多糖，这为牛蒡多糖的提取提供了参考。

1.2 牛蒡多糖的分离纯化及结构表征

牛蒡多糖的粗提物经脱蛋白、脱色、透析处理后得到不同聚合程度的多糖混合物，需进一步分离纯化得到单一的多糖组分[27]，便于后期多糖结构和相关活性的研究(见表1)。

粗多糖提取物中的杂质多为蛋白和色素。牛蒡粗多糖中脱除蛋白质常用Sevag法、酶法、鞣酸法等，现多将几种方法联用，提高蛋白脱除率的同时尽量减少多糖损失[28]。此外，有较深色泽的酚型化合物杂质常存在于牛蒡多糖提取液中，需通过脱色除去。常用的脱色方法有大孔树脂吸附法、离子交换法、活性炭吸附法等。离子交换法脱色一般是使用DEAE纤维素柱对色素进行吸附，不仅可以达到脱色的目的，还可以进行多糖的分离。除杂后的多糖仍然是不同级分的混合物，需对初步除杂后的多糖进行分离，得到单一的多糖组分。多糖的分离方法有离子交换层析法、凝胶柱层析法和大孔树脂柱层析等[29-30]。

多糖由于其单糖组成、链构形、环构象和分子质量等方面的多样性，使其分析具有一定的挑战性。牛蒡多糖相对分子质量的测定常采用高效空间排阻色谱(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)[24,31]、高效凝胶渗透色谱(high performance gel filtration chromatography, HPGPC)[6]等方法；牛蒡多糖的单糖组成研究，常将多糖进行水解和衍生化，然后采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)[32]、气相色谱法(gas chromatography, GC)[6]、薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)[24]、气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[3,10]、高效阴离子交换色谱(high performance anion exchange chromatography, HPAEC)[33]等进行分析。通过紫外光谱分析在260 nm和280 nm处有无吸收判断所提多糖中是否含有核酸和蛋白质[10-11]。通过红外光谱分析判断含有何种化学键或官能团[34]。目前，对牛蒡多糖结构分析的文献相对较少，可借鉴其他多糖的分析方法用于牛蒡多糖的结构分析。

表1 牛蒡多糖提取纯化条件及其结构Table 1 Extraction and purification conditions and structures of Arctium lappa L.polysaccharides

续表1

如表1所示，不同的提取方式、乙醇沉淀浓度及分离纯化方式所获得的多糖组分，其得率及结构(分子质量、糖链结构、单糖组成及其比例等)不同。ZHANG等[23]用碱液提取法提取多糖，过DEAE-52纤维素柱时，分别用蒸馏水、0.1 mol/mL和0.3 mol/mL NaCl溶液进行洗脱，其中0.3 mol/mL NaCl溶液洗脱后得到的组分中多糖含量最高，用于后续纯化及研究。经表征推测碱溶性多糖(alkali-solubleA.lappaL.polysaccharides, ASALPs)的主骨架可能为阿拉伯糖，与WANG等[6]报道的具有果糖主链和葡萄糖支链的结构有很大不同。

用于沉淀多糖的乙醇浓度是影响多糖平均分子质量和结构特征的决定性因素，而多糖的分子质量和结构与多糖活性密切相关。李卷梅[31]采用热水浸提法提取了牛蒡根中的多糖,用0.25%草酸铵溶液提取残渣中的多糖，并用20%、40%、60%及80%不同体积分数的乙醇分级沉淀，得到的多糖组分(ammonium oxalate extracted polysaccharides from burdock roots, AOE)分子质量不同且单糖组成也有差异，AOE-20、AOE-40、AOE-60、AOE-80的重均分子质量分别为485、409、371、5.21 kDa，AOE-20和AOE-40是以半乳糖醛酸为主的聚糖，而AOE-60和AOE-80是以果糖为主的果聚糖，且不同浓度的AOE具有不同的流变特性。JIANG等[10]采用超声辅助提取法，用终浓度分别为40%、60%和80%的乙醇沉淀多糖得到组分ALP40-1、ALP60-1和ALP80-1，其分子质量分别为218、178和60 kDa，甘露糖、葡萄糖、果糖和半乳糖是这3个组分的主要单糖，虽单糖组成相同但含量不同，ALP60-1中甘露糖含量最高为5.72%，在ALP80-1中葡萄糖含量为72.23%，半乳糖为8.05%，ALP40-1中果糖含量最高为38.29%。这3种组分对清除不同自由基的能力也有差异，其中ALP60-1的清除能力最强。袁平川[5]同样采用分段醇沉的方式得到不同的多糖组分，发现重均分子质量不同的牛蒡多糖抗氧化活性差异很大，同样是体积分数60%乙醇沉淀部分抗氧化效果最佳。研究表明牛蒡多糖有良好的抑制α-葡萄糖苷酶作用，但活性不稳定，猜想抑制酶活可能需要合适的分子质量，但多糖的分子质量不受控制，这也揭示了多糖特定的生物活性与它的分子质量存在联系[5]。

CARLOTTO等[24]得到的粗多糖在50 kDa聚醚砜膜处超滤得到保留组分(retained fraction, RF)50和洗脱组分(eluted fraction, EF)50，而后将EF50经30 kDa聚醚砜膜处超滤得到保留组分RF30和洗脱组分EF30。RF50、RF30和EF30这3种组分在结构分析上的结果相似，但RF30的抗水肿效果最好，认为各组分在摩尔质量上的差异和/或在化学结构上的微小差异可以解释它们在抗水肿作用上的差异。

综上，多糖的分子质量及化学结构与提取方法及过程密切相关，提取纯化过程中许多因素会影响多糖结构，进而可能影响多糖的生物活性。

2 牛蒡多糖的生物活性研究

牛蒡多糖具有多种生物活性，如抗炎、调节肠道菌群、降血糖及调节脂质代谢、抗氧化等(表2)。

表2 牛蒡多糖的结构、生物活性及作用机制Table 2 Structure, biological activity and mechanism of Arctium lappa L.polysaccharides

2.1 抗炎

炎症是由免疫系统在机体受到病原体侵入或感染的过程中作出的一种防御反应，同时伴随着多种病理病变[35]。巨噬细胞是免疫系统的重要成员，越来越多的证据表明巨噬细胞的激活是炎症反应的关键因素。研究发现牛蒡多糖具有较强的调节小鼠巨噬细胞吞噬功能和体液免疫功能的作用[36]。牛蒡多糖可作用于巨噬细胞，抑制促炎细胞因子包括白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)释放，增加抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的水平。NO是诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)释放的一种促炎因子[37]，过量的NO会导致全身炎症，ALPs可以抑制NO的释放[7]。

牛蒡多糖可以促进肠道中的短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)的产生，SCFAs包括乙酸、丙酸和丁酸，具有一定的抗炎作用[38]。乙酸和丙酸可以通过激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPRs)介导免疫，丁酸可以通过抑制核转录因子-kB(nuclear factor kappa B, NF-kB)信号通路的激活进一步调节促炎细胞因子的释放，还可以调节肠道巨噬细胞功能，抑制巨噬细胞内相关炎症介质水平[39]。

炎症过程中释放过多的炎性因子将导致中性粒细胞的炎性浸润，然后在体内发生氧化应激，同时氧化损伤意味着过量游离氧自由基的存在，反过来又加重炎症损伤[41]。许多研究表明牛蒡多糖有抗氧化活性，因此可通过降低氧化损伤而减轻炎症[23]。

此外，牛蒡多糖还可以调节肠道菌群与免疫之间的关系发挥抗炎作用。牛蒡多糖抗炎活性机制并不是独立的，是多个靶点综合的结果，其具体分子机制有待于进一步研究。

2.2 调节肠道菌群

由于人体内降解植物多糖类的酶活性很低甚至缺乏，大部分植物来源的多糖不能被人体直接消化利用；而肠道内的微生物呈现碳水化合物活性酶的多样性，可以弥补人体糖类代谢的不足。肠道微生物将多糖降解为SCFAs，这些酸参与多种生理功能，肠道菌群即是通过影响多糖代谢途径进而影响健康[40]。

肠道微生物与免疫密切相关，调节肠道菌群可以促进SCFAs等调节因子改善免疫反应[42]。天然多糖通过调节肠道微生物和免疫来维持宿主健康，多糖可以促进微生物生长减少病原体丰度[43]。多糖具有部分益生元功能，可选择性地刺激肠道有益微生物。徐永杰等[44]研究发现牛蒡多糖能使小鼠肠道中双歧杆菌和乳杆菌有效增殖，且增殖效果呈剂量依赖性，而对肠杆菌的数量无明显影响。

牛蒡多糖可以通过调节肠道菌群发挥抗炎作用。WANG等[6-7,23]所在课题组探究了牛蒡多糖对微生物丰度在门、科、属这3种不同水平上的影响，研究表明牛蒡多糖可以调节因炎症反应造成的肠道微生物的紊乱，使其恢复至正常或接近正常水平。厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形杆菌门(Proteobacteria)及放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度是评价炎症程度的重要指标，牛蒡多糖可以调节它们的相对丰度维持肠道平衡。瘤胃菌科(Ruminococcaceae)与多种肝脏疾病的发生呈负相关，毛螺菌科(Lachnospiraceae)可以降解多糖产生丁酸发挥抗炎作用，牛蒡多糖可以提高它们的水平。属水平的微生物组成和丰度是评价肠道状况的重要指标。乳酸菌(Lactobacillus)是公认的益生元，能保护肠道屏障，增强肠粘膜功能，抑制炎症。另枝菌(Alistipes)和臭杆菌(Odoribacter)与肠道炎症的减弱有关，可以促进肠道的成熟。拟杆菌(Bacteroides)参与炎症发展，与肠道炎症发生呈正相关。葡萄球菌(Staphylococcusand)与炎症反应成正相关，可加重炎症。牛蒡多糖可以增加Lactobacillus、Alistipes和Odoribacter的水平，抑制Staphylococcusand，改善炎症反应造成的肠道菌群的紊乱。考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)是SCFAs的另一个重要生产者，能促进乙酸和丙酸的释放，Odoribacter是肠道内合成丁酸的重要分子，而它们都能被ALPs富集，间接发挥抗炎作用[7]。

目前关于此活性的研究多为通过调节肠道微生物抑制炎症发挥免疫作用，探讨多糖调节肠道菌群与免疫之间的关系将会是未来研究的一大热点。

2.3 降血糖、调节脂质代谢

全球糖尿病地图(第九版)显示,2019年，全球糖尿病(20～79岁)粗患病率为9.3%，目前有4.63亿糖尿病患者，而中国糖尿病患者人数排第一。高血糖是糖尿病患者的一个严重问题，若不及时治疗会引起多种并发症[45]。糖尿病引起的脂质代谢异常是导致心血管疾病的直接因素，因此预防和治疗糖尿病引起的脂质代谢异常具有重要意义。

王佳佳等[34]研究表明，牛蒡多糖能有效降低血糖水平，这可能与抑制α-葡萄糖苷酶活性及降低氧化损伤有关，而LI等[46]和袁平川[5]的研究显示牛蒡多糖降血糖功能并不明显，可能是链脲霉素对机体多个器官造成损伤，尤其是胰岛损伤严重，可能构造的动物模型与模拟人体糖尿病存在较大差异，无法真实地反应牛蒡多糖对糖尿病的治疗，或是牛蒡多糖的抑制是一种末端降血糖的方式，需长期给药才能达到理想的效果，但研究的各项指标均表明牛蒡多糖在降血糖及调节脂质代谢等方面均有作用。血清生化分析显示，多糖治疗组的总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL)水平明显降低，脂质代谢更为有利。LI等[45]研究发现蛋白激酶C-α(protein kinase C alpha, PKC-α)、PKC-β和P-选择素(P-selectin)在糖尿病大鼠肝脏中的表达增加，说明PKC在糖尿病大鼠肝脏中被激活，与此同时它也促进了NF-κB信号通路的激活，增加肝脏中炎症因子的表达。研究表明高糖可以激活PKC，PKC诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，还可以单独或与其他物质一起促进NF-κB及其下游基因的表达，参与糖尿病的发生和发展；而牛蒡多糖可以抑制PKC的表达，阻断上述过程，以降血糖及调节脂质代谢。有研究表明糖尿病脂质代谢异常与氧化应激密切相关[47]，牛蒡多糖具有的抗氧化能力可以降低体内脂质过氧化物，减缓氧化应激导致的肝脏损伤及脂质代谢异常。

牛蒡多糖的降血糖及调节脂质代谢功能是多靶点共同作用的结果，其相关作用机制还需进一步研究。

2.4 抗氧化

正常代谢产生的过量自由基可诱导许多慢性疾病的发生，如冠心病和癌变等。为减少自由基对人体的危害，借助外源性的抗氧化剂来阻止自由基的入侵是防御的主要途径。大量研究指出多糖具有增强抗氧化酶活性、清除自由基、抗脂质过氧化等功能。LIU等[33]研究表明提纯后的牛蒡多糖具有较强的铁离子螯合和羟自由基清除能力，而清除过氧化氢的能力较弱；在D-半乳糖诱导的小鼠模型中，ALPs明显改善了抗氧化状态的多项指标，包括提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性，提高总抗氧化能力(total antioxidative capacity, TAOC)值，降低血清和肝脏中丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平。由此可见，ALPs可能对维持或改善抗氧化系统有良好的作用。

2.5 其他功能

除以上生物活性外，牛蒡多糖还有抑制K562细胞增殖、抑菌、抗水肿等功能。

孟宇等[49]研究表明牛蒡多糖能抑制白血病K562细胞的增殖，这可能与Bcl-2基因表达降低、Bax表达上调、调控Bcl-2/Bax比例有关，其机制有待进一步研究。喻俊[3]采用滤纸片扩散法得出牛蒡纯多糖片段在一定浓度范围内能有效抑制大肠杆菌、枯草杆菌、铜绿甲单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长，表明牛蒡纯多糖具有抑菌作用。水肿的形成是急性炎症的早期征象之一，是由富含蛋白质的液体(血浆)渗出进入损伤部位所致。CARLOTTO等[24]研究了牛蒡粗多糖的抗水肿效果，结果表明，粗多糖能以剂量依赖性抑制卡拉胶诱导的小鼠爪水肿，其ID50值为31 mg/kg。王家辉等[32]研究发现，牛蒡根多糖有延长凝血酶原时间的作用，但与肝素钠相比效果明显较弱，并没有表现出良好的抗凝血活性。

3 展望

牛蒡作为一种药食同源植物，除本身较高的营养价值外，其药用和保健功能也一直备受关注。多糖是牛蒡中重要的活性物质，具有多种生物活性功能，在食品和医药等领域有广阔的应用前景。牛蒡多糖结构复杂，不同的提取纯化技术得到的多糖分子质量不一，糖链结构和单糖组成也有差异。目前对牛蒡多糖生物活性研究多停留在粗多糖水平，机制的探究尚不够深入。未来需改进或探究新的提取方式以提高多糖得率，并加强对牛蒡多糖高级结构及构效关系的研究，扩展新活性、明确作用机制，探求糖结构作用的有效靶点；利用新兴技术对牛蒡多糖结构进行修饰，提高其生物活性，以利于应用及产业化。