miR-424-5p在结直肠癌中的表达及其对预后的价值

黄志勇 林智远 陈淑贤

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，全球每年约有50 多万人死于此病[1]，仅次于乳腺癌、前列腺癌和肺癌[2]。肿瘤患者通常确诊时平均年龄69 岁，其中大于65 岁占60%，大于75 岁占36%[3]。结直肠癌的发展与饮食习惯和生活方式有关。在这些危险因素中，肥胖[4]、吸烟[5]、酗酒以及高脂肪和低膳食纤维的食物[6]起主导作用。结直肠癌早期临床症状很不明显，因此患者被确诊时一般都处于肿瘤中晚期，已错过最佳治疗期[7]。用于检测的肿瘤标志物，也称为生物标志物，是由癌细胞或身体其他细胞产生的物质对癌症的反应。癌胚抗原（CEA）是结直肠癌最常用的肿瘤标志物，其次是CA125、CA19-9[8]，但CEA、CA125、CA19-9 敏感性均较低，无法早期诊断结直肠癌[9，10]。目前，尚无有效的早期生物标志物用于诊断结直肠癌，因此我们需要寻找结直肠癌早期诊断的生物标志物，以期达到早期诊断。

miRNA 是小的非编码RNA 序列，通过与mRNA结合而诱导基因降解或翻译受阻，从而抑制基因表达，在很多肿瘤的发生发展中发挥作用[11]。miRNA作为临床生物标志物的潜在用途成为近年来的研究热点，其稳定性高和相对容易的检测使其成为快速、无创诊断的理想指标[12]。miRNA 微阵列可以同时识别同一样本中几百个基因的表达，为检测miRNA 的表达提供了一种稳健的方法[13]。这些高通量阵列的广泛和全面使用使miRNA 表达的量化和其在物种内和物种间的鉴定成为可能[14]。目前有很多研究已经指出多种miRNA 对肿瘤的诊断和预后具有较高价值，例如计算Delta 循环阈值法比较Ct miR-503 与Ct miR-511 之间的差异，对肾上腺皮质癌与良性腺瘤的诊断具有高度的敏感性和特异性[15]；miR-451 表达下调与胃癌预后不良相关[16]；慢性淋巴细胞性白血病中miR-34a 低表达，可以作为其预后不良的标志[17]等。miRNA 在结直肠癌的诊断中也发挥了重要作用，结直肠癌患者血清外泌体中的某些特定的miRNA（miR-638、miR-5787、miR-8075、miR-6869-5p 和miR-548c-5p）可以作为结直肠癌的生物标志物[18]。研究显示，miR-424-5p 在结直肠癌组织和正常组织中也存在显著差异，且可以通过靶向CCNE1 抑制结直肠癌细胞的恶性发展[19]。

本研究通过检测并比较89 例结直肠癌患者的结直肠癌组织及配对的癌旁正常组织中miR-424-5p 的表达水平，绘制ROC 曲线研究其在结直肠癌中的诊断意义。同时对这89 例患者随访，探究miR-424-5p 表达对结直肠癌的预后价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料本研究选择2016年7月～2019年3月我院收治的89 例结直肠癌患者，均通过病理确诊为结直肠癌。其中男45 例，平均年龄（63.4±9.2）岁，女44 例，平均年龄（60.3±12.7）岁。患者术前均未接受任何放化疗或免疫治疗，临床病理资料完整，患者及其家属知情且签署知情同意书。在手术期间获得患者结直肠癌组织样本及配对癌旁正常组织样本（距离肿瘤组织2cm），样本切除后均于液氮中快速冷冻。样本的肿瘤组织学均经过资深病理医生认证，样本获取过程符合我院伦理委员会的要求。

1.2 检测方法通过实时定量荧光PCR（qRT-PCR）对患者的结直肠癌组织和癌旁正常组织中的miR-424-5p 的表达水平进行检测。使用mirVana 试剂盒（Life Technologies）操作说明分离miRNA。然后使用Superscript Ⅱ试剂盒（Invitrogen）将总RNA 反转录。根据SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa，Dalian，China）说明操作，在Applied Biosystems 7500 序列检测系统（Applied Biosystem）上进行qRT-PCR，反应程序设置为：95℃ 30s（变性）；95℃ 5s（复性），60℃ 34s（延伸），40 个循环，每个反应样本设置3个复孔。引物设计：has-miR-424-5p：正向特异性引物：5'-CAGCAGCAATTCATGT-3'，反向特异性引物：5'-TGGTGTCGGAGTCG-3'；U6 内参基因：正向特异性引物：5'-CTCGCTTCGGCACGACA-3'，反向特异性引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用2-ΔΔCt值计算miR-424-5p 的表达水平。

1.3 统计学方法统计过程在GraphPad Prism 软件（8.0 版，GraphPad software, Inc.， La Jolla, CA，USA）和SPSS 软件（26.0 版，SPSS Inc.， Chicago，IL）进行。采用Kaplan-Meier 曲线分析结直肠癌患者的总生存期。利用ROC 曲线检测miR-424-5p 在结直肠癌中的诊断能力。通过SPSS 26.0 绘制ROC 曲线，使用秩和检验计算曲线下面积（AUC）。面积越大，判断值越高。

1.4 随访89 例患者均至少随访1 次。总生存期（OS）是指从手术后第1 天到死亡或最后一次随访的持续时间，无进展生存期（DFS）是指患者从手术第1 天开始到复发转移前的生存时间。随访期从患者接受治疗的第1 天开始，截至2019年11月31日，89 例患者随访8～30 个月，中位数为11.7 个月。整个过程中无失访，随访率为100%。

2 结果

2.1 miR-424-5p 在结直肠癌组织中的表达情况结直肠癌组织中的miR-424-5p 表达水平为0.899±0.197，显著低于正常组织的1.296±0.241，根据结直肠癌组织和正常组织中的miR-424-5p 表达量差异绘制ROC 曲线（见图1）。可知曲线下面积（AUC）：0.899，特异性：89.9%，灵敏度：76.4%，约登指数：66.3%，cut-off 值：1.0915。提示miR-424-5p在结直肠癌中具有较高的诊断价值，且具有很好的灵敏度和特异性。

2.2 miR-424-5p 低表达与结直肠癌患者预后的关系生存分析显示，在结直肠癌中，miR-424-5p 低表达结直肠患者的总生存期明显比高表达的短,低表达的miR-424-5p 提示了结直肠癌患者较低的总生存率（见图2A）。DFS 曲线显示miR-424-5p高表达的结直肠癌患者的无进展生存期明显长于miR-424-5p 低表达。提示miR-424-5p 低表达代表了较短的无进展生存期（见图2B）。miR-424-5p在结直肠癌患者总生存率中的预后价值ROC 曲线显示AUC：0.703，cut-off 值：1.1875，灵敏度68.9%，特异性77.3%（见图2C）；miR-424-5p 在结直肠癌患者无进展生存期中的预后价值ROC 曲线显示AUC：0.716，cut-off 值：1.0125，灵敏度67.1%，特异性68.4%（见图2D）。提示miR-424-5p 低表达与结直肠癌患者预后不良相关，AUC 值提示miR-424-5p 表达在结直肠癌中具有较好的预后价值，但灵敏度和特异性相对不高。

图1 miR-424-5p 在正常组织和结直肠癌中表达水平及诊断价值

图2 miR-424-5p 总生存率和无进展生存期及对应的预后价值

3 讨论

2010年欧洲已经发现结直肠癌是第三常见的恶性肿瘤[20]。尽管与某些肿瘤相比，结直肠癌的死亡率较低，但是结直肠癌的临床管理常因多种相关合并症而变得复杂，进而对健康经济产生负面影响[21]。而且我们了解到，结直肠癌治疗的主要问题包括术后肿瘤的高复发率以及在随访期间频繁的侵入性诊断检测。因为结肠镜检查的高成本和其不便利使得患者依从性很低[22]，所以发现更优异更容易接受的诊断手段和诊断标志物成为结直肠癌治疗过程中亟需解决的问题。

研究显示miRNA 可从不同的生物样品中提取（不局限于组织），包括血清、唾液[23]、粪便[24]。有研究发现miRNA 在肿瘤早期就具有高特异性和灵敏度[25]。本实验选择miRNA 作为结直肠癌诊断及预后标志物进行实验。有研究表明，miR-424-5p 在结直肠癌组织和正常组织中表达水平存在显著差异[19]。我们的检测结果则证实，根据组织中miR-424-5p 的表达水平差异，可以将其作为结直肠癌的诊断标志物。ROC 分析结果显示，miR-424-5p 低表达对结直肠癌具有较高的诊断价值，其灵敏度和特异性也较高；生存分析结果显示，miR-424-5p 低表达时结直肠癌患者的总生存期和无进展生存期均更短，ROC 分析结果同样提示miR-424-5p 低表达与结直肠癌患者预后不良相关。

本研究检测组织中miRNA 的表达水平发现其可以作为结直肠癌诊断和预后的标志物。今后还需进一步大样本研究，以进一步证实以上结论。