米氏凯伦藻抑藻菌的分离鉴定及抑制效应*

杜文俊, 冯燕楼, 安 莹, 褚夫敏, 段晓洋， 丁 宁

(曲阜师范大学生命科学学院，273165，山东省曲阜市)

1 材料与方法

1.1 实验藻种与细菌培养基

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻种由中国海洋大学藻种培养实验室提供. 培养液为改良f/2营养液，成分参照Guillard的方法[9]. 米氏凯伦藻在光照强度为3000 μmol·m-2·s-1，光暗比为12 h∶12 h，温度为(25±1) ℃的光照培养箱中培养至对数生长期. 细菌2216E培养基：蛋白胨5 g,酵母膏1 g,磷酸高铁0.1 g,陈海水1000 mL，正向琼脂粉1.5 g(固体培养基).

1.2 实验方法

1.2.1 细菌分离筛选

于无菌操作台中取对数生长期的米氏凯伦藻藻液稀释成不同的浓度梯度,各移取0.1 mL至2216E固体培养基上,用涂布棒均匀涂布,于25 ℃恒温培养箱中倒置培养,待其长出单菌菌落后按照形态、颜色不同采用划线法进行单菌的分离纯化,挑取单菌接种于经高温灭活的2216E液体培养基中,于25 ℃、150 r·min-1恒温培养箱中培养3天,用于单菌DNA提取,剩余的用15% (V/V)甘油于80 ℃超低温冰箱中储存备用.

1.2.2 细菌DNA制备及序列分析

待测菌株经培养3天后经高速离心收集得到菌体，用AXYGEN AxyPrep基因组提取试剂盒提取细菌DNA. 以正向27F和反向1492R为引物扩增细菌16S rRNA基因序列；取3 μL PCR产物跑电泳,用凝胶图像处理系统观察并选取条带明亮且单一的扩增子送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序；将测序所得的序列在GenBank上与数据库已有的细菌16S rRNA序列进行blast比对,通过Clustal X建立aln文件,用软件MEGA4.1对菌株系统发育树进行构建.

PCR(LC480II型)扩增体系和反应程序为：25 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 23 μL；95 ℃预变性6 min，94 ℃变性50 s,60 ℃退火50 s,75 ℃延伸80 s，35个循环后，75 ℃延伸10 min.

1.2.3 抑藻试验

取经过分离纯化……