低分子量鱼精蛋白修饰的PLGA 纳米粒应用于内耳毛细胞递送的分布特性考察

詹宏青，孙丽芳，谢石宝，温露，陈钢,2,3

（广东药科大学1.药学院；2.广东省药物新剂型重点实验室；3.广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心，广东广州510006）

世界卫生组织2021年《世界听力报告》显示，目前全球五分之一的人听力受损，严重影响了人们的生存质量[1-2]。目前的临床药物可以缓解听力损失，但不能完全治愈，因此探索治疗听力损失的新方法已经成为医药领域的研究热点[3]。内耳毛细胞损伤是发生听力损失的重要原因，且哺乳动物的感觉毛细胞不能再生，因此靶向内耳毛细胞给药至关重要，但目前将药物递送至内耳毛细胞仍十分困难[4]。

细胞穿膜肽（cell-penetrating-peptides，CPPs）即蛋白质转导结构域（PTD），是一类由5～30 个氨基酸组成的短肽，能高效地穿过生物屏障，因此被广泛地用于各种大分子和纳米结构化系统的细胞内递送。低分子量鱼精蛋白（low molecular weight protamine，LMWP）是FDA 批准的药物鱼精蛋白的酶消化产物，由Yang 教授的研究团队发现，是目前研究较广泛的CPP[5]。同时，他们还对LMWP 修饰的PLGA 纳米粒克服乳腺癌耐药性进行研究，结果显示该递药系统具有良好的治疗效果，且无可检测到的毒性[6]。除了强大的渗透力，LMWP 的安全性也在体外实验和啮齿动物及狗中得到证明[7-9]。本课题组之前的研究表明，通过改变PLGA 纳米粒的大小能够提高药物在内耳的分布，并且将该PLGA 纳米粒与LMWP 和其他3 种穿膜肽TAT、Penetratin 和R8 分别混合，与LMWP 混合的PLGA 纳米粒在耳蜗中显示更强的摄取[10-11]。因此，本文利用LMWP 修饰PLGA 纳米粒，通过2 种体内动物模型的研究，考察该纳米粒的分布特性，为内耳毛细胞的药物递送提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；GL-2型磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；TDL80-2B 离心机（飞鸽牌）；DelsaTMNano C Zeta 电位仪（美国Beckman coulter 公司）；Nano S90 激光粒度仪（英国马尔文公司）；LSM 710激光扫描共聚焦荧光显微镜（德国卡尔蔡司股份公司）；FIBO 小动物活体荧光成像（韩国NeoScience公司）。

1.2 材料

PLGA（LA∶GA=75∶25，相对分子质量10 000，山东省医疗器械研究所）；香豆素-6（质量分数98%，美国Sigma-Aldrich公司）；尼罗红（质量分数98%，广州市齐云生物科技有限公司）；低分子量鱼精蛋白及罗丹明B-低分子量鱼精蛋白（氨基酸序列VSRRRRRRGGRRRR，上海吉尔生化有限公司）；DASPI（Sigma）；细胞骨架蓝色荧光探针（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

HEI-OC1 细胞，源自于美国House Ear Institute（HEI），是从新生小鼠耳蜗Corti 氏器中分离培养得到的永生化贴壁细胞。野生型（wildtype，WT）AB 系的斑马鱼（Danio rerio），购自南京一树梨花生物科技有限公司。FMMU 品系的普通级豚鼠，体质量200～300 g，雌雄不限，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（粤）2017-0125。

2 方法

2.1 LMWP修饰PLGA 纳米粒的制备

称 取30 mg 的PLGA 和1 mg 香 豆 素-6 或 尼 罗红，溶于1 mL的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂中（体积比3∶7），得到有机相。配制质量浓度为3%的PVA 溶液5 mL 作为水相。将有机相加入到水相。在冰浴的条件下，探头超声30次（工作5 s，间隙5 s，功率190 W）；用15 mL 0.5%的PVA溶液稀释，磁力搅拌3 h，挥发有机溶剂，低速离心（3 000 r/min，10 min），随后进行超高速离心（18 000 r/min，30 min），蒸馏水复溶沉淀得到未修饰的PLGA纳米粒。

将一定量的LMWP 用适量的PBS 溶液溶解，再与未修饰的PLGA 纳米粒溶液混合，置摇床中冰浴振荡3 h（100 r/min），期间每30 min 更换1 次冰水，即得LMWP 修饰的PLGA 纳米粒溶液，以2%的甘露醇为冻干保护剂，冻干备用。

2.2 LMWP修饰PLGA 纳米粒的表征

取适量LMWP修饰的PLGA 纳米粒溶液用蒸馏水稀释到合适的浓度，润洗比色皿3 次，取1 mL 体积的纳米溶液于激光粒度仪测定粒度分布和多分散系数，另取纳米粒溶液于电位分析仪检测电位。

取LMWP 修饰的PLGA 纳米粒溶液适量，滴加到圆形铜网上，自然风干后用0.2%的磷钨酸染色，室温条件下晾干，置于80 kV 的透射电镜下观察纳米粒的形态。

2.3 细胞毒性实验

称取适量LMWP 修饰的PLGA 纳米粒冻干粉末，用培养基稀释至质量浓度为15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL 的溶液。将HEI-OC1 细胞接种于96 孔板中培养24 h，分别加入上述不同质量浓度的纳米粒悬液100 μL，共孵育24 h 后弃去含药的培养基，随后加入MTT 试剂共孵育4 h，小心弃去上清，每孔加100 μL的DMSO，恒温震荡10 min。用酶标仪测定490 nm 处的吸光度值，按照下列公式计算细胞存活率：

细胞活力/%=[A加药-A空白]/[A不给药-A空白]×100%A加药：具有细胞、MTT 溶液和药物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培养基和MTT 溶液而没有细胞的孔的吸光度；A不给药：具有细胞、MTT溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

2.4 斑马鱼摄取实验

将斑马鱼幼鱼（6 dpf）用吸管转移至96孔板内，每孔4尾幼鱼，3个复孔。设置LMWP修饰与未修饰的PLGA 纳米粒组，孵育一定时间后吸弃药液，加入多聚甲醛固定12 h，弃去固定液，胚胎培养液洗3次，再加入0.005%的DASPEI染色15 min，胚胎培养液清洗3 次。甘油铺片，指甲油封片以防甘油漏出导致样品移位。命名后放入切片盒，于冰箱4 ℃放置保存待激光共聚焦拍照。在激光扫描共聚焦荧光显微镜观察斑马鱼的头部、尾部和毛细胞，并在相应的激光通道下进行呈像。

2.5 豚鼠体内分布实验

2.5.1 纳米粒的荧光成像 将豚鼠随机分为3组，分别为生理盐水组、未修饰的PLGA 纳米粒组，LMWP修饰的PLGA 纳米粒组，给药方式为耳后注射3 μL溶液。30 min 后，腹腔注射过量20%乌拉坦溶液使豚鼠深度麻醉，断头处死并取出听泡。用PBS 冲洗听泡表面残余的纳米粒溶液，放置在表面皿上进行荧光成像（滤光片），并用软件NEO image for FOBI统计各个耳蜗的荧光强度。

2.5.2 纳米粒在基底膜的分布 随机将豚鼠分为未修饰的PLGA 纳米粒组、LMWP 修饰的PLGA 纳米粒组，每组6只豚鼠。豚鼠麻醉后，单侧耳后注射3 μL纳米粒溶液。分别于给药30 min 后深度麻醉处死豚鼠，取听泡，随后从鼓室下方剪开听泡，用尖镊在蜗尖钻一小孔，取出镫骨刺破圆窗膜，用1 mL 注射器吸取4%多聚甲醛固定液从蜗尖灌流固定，固定过夜。第2 天在体式显微镜下进行耳蜗基底膜取材，随后将取得的内耳组织用0.1%的Triton X-100溶液洗涤3 次，于工作液中避光染色70 min。染色时间到后，吸弃染色液，PBS 洗3 次。将染色完毕的组织放置于滴有甘油的载玻片上，将基底膜纤毛面朝上，铺片完毕再封固盖玻片4 周，存放于4 ℃的冰箱中。使用激光共聚焦显微镜观察并拍照记录。

3 结果

3.1 纳米粒的表征

从未修饰与LMWP修饰的PLGA纳米粒的粒径分布及电位检测结果（图1A、B）可见，在25 ℃的温度条件下，测得未修饰的PLGA 纳米粒的粒径为143.9 nm，多分散系数（PDI）为0.093，带负电（-7.07 mV）；经LMWP修饰的PLGA 纳米粒的粒径为153.6 nm，多分散系数（PDI）为0.112，带正电（+6.56 mV），表明制备得到的纳米粒子粒径大小适宜，分布均匀，体系一般稳定。从未修饰与LMWP修饰的PLGA 纳米粒的TEM 结果（图1C、D）可见，修饰前后的纳米粒形态基本一致，制得的纳米粒子近似球形，粒径略小于实际测量值，分散性良好，几乎无团聚现象。

3.2 细胞毒性实验结果

LMWP 修饰PLGA 纳米粒的体外细胞毒性结果见图2。结果显示，LMWP 修饰的PLGA 纳米粒具有较低的细胞毒性，仅在高浓度时（≥2 000 μg/mL），LMWP 修饰的PLGA 纳米粒才显示出一定的细胞毒性。

3.3 斑马鱼的体内分布结果

图3 为未修饰的PLGA 纳米粒的斑马鱼摄取结果，可见，未修饰的PLGA 纳米粒溶液在头部、尾部和侧线毛细胞的红色通道具有明显的荧光，表明未修饰的PLGA 纳米粒能够被斑马鱼摄取，并到达侧线毛细胞。图4 为LMWP 修饰的PLGA 纳米粒组的斑马鱼摄取结果，可以看到斑马鱼全身有大量的尼罗红的荧光分布，与未修饰的PLGA 纳米粒组相比，侧线毛细胞的荧光强度更强，表明LMWP 修饰的PLGA 纳米粒能够有效地被斑马鱼侧线毛细胞摄取，LMWP的修饰提高了对纳米粒的摄取量。

3.4 豚鼠的体内分布结果

以豚鼠为实验动物模型，通过荧光成像考察LMWP 修饰的PLGA 纳米粒与未修饰的PLGA 纳米粒经局部给药在内耳的总体摄取量，结果见图5。可见，LMWP 修饰的PLGA 纳米粒比起未经修饰的PLGA 纳米粒在耳蜗的荧光强度显著增强（P＜0.05），表明LMWP可以促进纳米粒进入内耳。

图1 未修饰或LMWP修饰的PLGA纳米粒的表征Figure 1 Characterization of unmodified PLGA NPs and LMWP-PLGA NPs

图2 LMWP修饰PLGA纳米粒与HEI-OC1细胞共孵育24 h的细胞存活率Figure 2 Cell viability of LMWP-PLGA NPs after incubated with HEI-OC1 cells for 24 h

图3 未修饰的PLGA 纳米粒与斑马鱼共孵育的体内分布结果Figure 3 In vivo distribution of unmodified PLGA NPs after co-incubation with zebrafish

图4 LMWP修饰PLGA 纳米粒与斑马鱼共孵育的体内分布结果Figure 4 In vivo distribution of LMWP-PLGA NPs after co-incubation with zebrafish

未修饰的PLGA 纳米粒经耳后注射后在豚鼠耳蜗基底膜的分布结果见图6。结果显示，耳蜗基底膜三回毛细胞排列整齐，无缺失，染色情况良好，在红通道未见荧光，表明未修饰的PLGA 纳米粒无红色荧光干扰。未修饰的PLGA 纳米粒在绿通道中显示出较弱的荧光，基底膜底回几乎未见绿色荧光，基底膜中回和顶回具微弱荧光。LMWP 修饰的PLGA纳米粒经耳后注射后在豚鼠耳蜗基底膜的分布结果见图7。结果显示，该纳米粒经局部给药后在耳蜗基底膜三回均有分布，表明经LMWP 修饰后的PLGA 纳米粒能够进入耳蜗并且被毛细胞摄取。底回的红色和绿色荧光较弱，表明纳米粒分布较少，结合荧光共定位来看，纳米粒在中回和顶回的摄取明显增加，说明LMWP 能有效地促进纳米粒在中回和顶回毛细胞的摄取。

图5 未修饰与LMWP修饰的PLGA纳米粒的荧光成像及荧光强度统计结果Figure 5 Fluorescence imaging and intensity statistics of unmodified and LMWP-PLGA NPs

图6 未修饰的PLGA纳米粒在耳蜗基底膜的分布Figure 6 Distribution of unmodified PLGA NPs in cochlear basilar membrane

4 讨论

在过去的十多年，基于纳米系统的递送策略将药物有效递送到内耳被认为是最有吸引力的方法之一，引起了学者极大的兴趣[12]。纳米递送系统展现出了高效、靶向、降低毒性等优势，是目前研究比较热门的递送体系。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）已经批准聚乳酸-羟基乙酸共聚物[（Poly(lactic-co-glycolic acid），PLGA]纳米粒用于注射给药[13]。有研究指出，PLGA纳米粒经局部给药后主要分布在耳蜗圆窗膜、外淋巴、基底膜、血管纹以及Corti器官内，但关于纳米粒靶向分布至内耳毛细胞的研究报道较少。与此同时，为了增强药物在内耳的递送，有必要寻找一种“促透剂”，将“促透剂”与载体材料PLGA 结合，达到一个协同促进药物递送至内耳毛细胞的目的。

图7 LMWP修饰的PLGA 纳米粒在耳蜗基底膜的分布Figure 7 Distribution of LMWP-PLGA NPs in the cochlear basilar membrane

穿膜肽是一类具有穿透各种生物膜功能的多肽分子，可以促进蛋白质、多肽、纳米粒等各种大分子进入细胞。因此，本研究将LMWP 修饰在PLGA纳米粒表面，考察其应用于内耳递送的分布特性。本文结果显示，所制备的LMWP 修饰的PLGA 纳米粒为形状圆整的类球形，粒径约为150 nm，具有合适的粒径和分散性。经LMWP 修饰后PLGA 纳米粒带正电，猜测可能是LMWP 吸附在PLGA 纳米粒上使它荷正电[6]。此外，基于本课题组之前的研究[11]，该纳米粒的冻干粉末在室温下应能稳定储存长达2个月。体外细胞毒性结果表明，该纳米粒具有良好的细胞相容性，只有在高浓度才显示出毒性。文星星等[14]研究结果表明，质量浓度为0～25 mg/mL 的PLGA 纳米粒与HEI-OC1 细胞共孵育24 h 没有明显毒性，故猜测LMWP 可能由于自身带正电荷而引起轻微的细胞毒性。斑马鱼具有生长周期短、繁殖能力强、基因与人类基因相似度达到87%等生物学特性。另外，斑马鱼侧线毛细胞与内耳感觉毛细胞功能及分子结构极为相似，被广泛作为研究内耳科学领域的实验动物模型[15]。此外，豚鼠耳壳大，存在明显的听觉耳廓反射，听力十分敏锐，常被作为研究听觉和内耳疾病的动物模型。本研究采用这两种动物模型，研究证实LMWP 的修饰显著增加PLGA纳米粒在毛细胞的分布，提示LMWP 修饰的PLGA纳米粒在内耳药物递送方面具有较大的潜力。研究表明，纳米粒表面带正电荷将促进其细胞摄取，而且纳米粒的摄取主要是由网格蛋白内吞作用介导[16-17]。因此，推测经LMWP 修饰的PLGA 纳米粒通过表面的正电荷与负电的细胞膜相互作用，以网格蛋白介导的内吞方式进入内耳毛细胞。综上，本研究为优化内耳毛细胞递送系统的处方设计提供参考，为将LMWP 修饰的纳米粒用于防治听力损失的药物递送奠定实验基础。