单增李斯特菌质粒研究进展

毛 盼，叶长芸

单增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)是一种兼性厌氧的革兰阳性食源性病原菌，可引起人或动物的流产、败血症、脑膜炎、脑膜脑炎等严重疾病。免疫力缺陷或低下的人群易感，致死率高达20%～30%[1]。单增李斯特菌以胞内寄生的方式引起动物和人类患李斯特菌病，亦以腐生方式存在于环境中，广泛分布于土壤、农作物、污水、动物和食物环境。单增李斯特菌具有很强的抵抗多种不同应激压力的能力，包括广范围的pH条件、不同温度、高盐、消毒剂等[2]。单增李斯特菌可形成生物膜持续定植于食品加工环境，易造成交叉污染而引起食源性感染暴发。单增李斯特菌具有高致病性、分布广、耐受力强等特点，是威胁食品安全和引起公共卫生问题的重要病原菌之一。

单增李斯特菌具有强大的环境适应能力，单增李斯特菌质粒与其抗逆性有关。质粒是细菌染色体外具有遗传功能的DNA，非细菌生长代谢的必需元件，在辅助宿主菌的生存和适应中发挥重要作用。质粒可介导细菌间遗传物质的转移，使受体菌获得供体菌的选择性优势，如抗逆性、毒力、耐药等。上世纪80年代，Perez-Diaz等[3]首次报道了单增李斯特菌质粒，后来的研究发现质粒在单增李斯特菌中分布广泛，并发挥一定的生物学功能。本文将对单增李斯特菌质粒的分类、分布以及生物学特性等研究进展进行概述。

1 单增李斯特菌质粒分类及分布

Kuenne等[4]对李斯特菌属14个质粒基因组进行比较分析，发现所有质粒为同一种复制子类型，属于θ复制质粒pAMbeta1，提示这些质粒为同一祖先来源，该质粒复制子的宿主谱很广，具有在属内菌株间水平转移的潜能。多项研究根据李斯特菌质粒repA基因，对质粒进行分类[3，7]。目前Hingston等[5]研究对单增李斯特菌质粒分类较为全面，分为G1和G2两个组别，G2又分成两个亚组。G1质粒(26～88 kbp)较小但携带更多的可移动元件(如前噬菌体、转座子、插入序列)，G2质粒(55～107 kbp)较大，G2组的sub2亚组质粒均编码毒力相关蛋白(如细胞表面蛋白、分泌蛋白E)。G2质粒的GC含量(36.6%～37.7%)稍高于G1质粒(34.4%～36.9%)。所有质粒均编码RepA(质粒复制机制)、RepB(质粒分配机制)以及核酸外切酶(DNA修复机制)。同一单增李斯特菌菌株的不同基因片段中出现多个repA基因现象，提示存在多质粒的可能性，NCBI基因组数据中已发现在1株单增李斯特菌中存在5个质粒[5,8-9]。已有报道采用PCR方法扩增不同类型的复制子对大肠杆菌等细菌的质粒进行分型[10]，而关于单增李斯特菌质粒尚无统一的分型标准。

研究发现单增李斯特菌中质粒的携带率为28%～90%，大小为14～106 kbp[11]。相比临床菌株，质粒在环境和食品源性的菌株中更为常见。食源性单增李斯特菌中持续性菌株的质粒分离率高达75%，而散发菌株的质粒分离率为35%[11]，提示质粒对宿主菌在环境中的生存能力和适应性具有一定辅助作用。部分型别的单增李斯特菌中携带同一高度保守质粒，如ST121型、ST204型[12-14]，ST8型单增李斯特菌的质粒分为两个组别(n=10)，两组质粒序列差异显著，但每个组别内的质粒序列高度保守[15]。

早期研究单增李斯特菌质粒主要通过PCR扩增repA基因检测质粒的存在。近年来随着基因组测序技术的发展，质粒谱和比较基因组学研究取得重大进展。Naditz等[9]分析了32个国家近60年来的1 924株单增李斯特菌基因组，发现质粒总分离率为53%，大小为3～140 kbp。这些质粒基因具有高度保守性，核苷酸同源性最低为91.9%。该研究发现ST121、ST5、ST3、ST8、ST204型菌株质粒携带率较高(>50%)，ST1和ST2型菌株质粒携带率较低(<15%)，ST4型菌株均不携带质粒。质粒携带率与菌株类型有关，部分质粒仅存在于特定型别的单增李斯特菌，如pLM6179仅在ST121型菌中检测出[9,11-12]，而部分质粒分布广泛，如质粒pLMG1-7、pLMG2-7存在于多个单增李斯特菌血清型菌株，并在多个国家分离菌株中存在，但具体功能不明[5]。

2 单增李斯特菌质粒的生物学功能

2.1质粒相关功能基因 已有研究发现单增李斯特菌质粒携带功能基因分别与重金属抗性、消毒剂抗性、氧化应激抗性、热抗性、盐抗性、毒力、耐药性等相关(表1)。 IV型分泌系统在质粒的结合转移发挥了重要作用。毒素抗毒素系统编码一种稳定的毒素及一种不稳定的抗毒素，为质粒解离后致死系统(PSK)，具有维持质粒稳定存在的功能。虽然维持质粒基因的稳定对宿主具有一定负担，但其功能基因在特定条件下发挥作用有利于宿主菌的生存。

表1 单增李斯特菌质粒功能相关因子Tab.1 Plasmid-associated function factors in L. monocytogenes

2.2 环境压力抵抗能力

2.2.1苯扎溴氨抗性 苯扎溴铵等季铵化合物消毒剂被广泛应用于食品加工和医疗环境的消毒。长期频繁地使用消毒剂导致抗性菌株的产生并在环境中定植，可通过交叉污染转移至食品中或造成院内感染。关于单增李斯特菌质粒携带的bcrABC基因介导苯扎溴铵抗性的研究较多，Dutta V等[25]发现116株不同来源的单增李斯特菌中71株具有苯扎溴铵抗性，除了1株外均含bcrABC基因。Xu D等[16]发现携带bcrABC的质粒可水平转移至大肠杆菌。Elhanafi等[26]在1998—1999年多地李斯特菌病的暴发菌株中均检测出苯扎溴铵抗性相关的质粒pLMST6，消除该质粒后菌株的苯扎溴铵抗性减弱，野生株在苯扎溴铵刺激后外排泵EmrC及其TetR家族转录调控因子的mRNA和蛋白表达水平均显著增高。

2.2.2重金属抗性 单增李斯特菌广泛分布于土壤、污水、动物和食品等环境中。环境中的重金属污染广泛，重金属稳态对单增李斯特菌维持双重腐生和寄生方式至关重要[27]。单增李斯特菌质粒常携带重金属抗性(如镉、铜、锌、汞、砷抗性)，关于镉抗性的研究较多。金属镉在农业和工业中的广泛使用，如污水排放、垃圾焚烧和化肥施用，镉污染出现在土壤、水和空气中，并最终进入食物链。质粒的镉耐受基因盒编码P-ATP依赖的镉外排泵(cadA)及其转录调控因子(cadC)。与染色体上的基因cadA4相比，质粒携带的抗性基因可产生更强的镉抗性[5,28]。质粒编码的CadA1和CadC1常位于Tn5422转座子上，质粒携带镉抗性基因率较高可能与此转座子有关。部分质粒亦编码CadA2、CadC2，如pLM80[16]。在质粒镉抗性基因附近常携带其他金属转运体和多铜氧化酶(Mco)[29]。

2.2.3其他抗性 近年来，单增李斯特菌质粒与宿主菌抵御各种恶劣环境的关系备受关注。Naditz等[11]对持续性菌株的基因组特征分析发现，质粒p4KSM(ST5)、pLMR479a(ST8)、pLM6179(ST121)在特定ST型别菌株中分离率高，提示这些质粒可通过提高宿主菌对高盐、氧化应激等耐受性而利于宿主菌的生存。Zhang等[30]发现质粒pLMSZ08可促进宿主菌形成生物膜，该质粒消除后细菌的生物膜形成能力减弱，但质粒上生物膜形成相关的基因尚未明确。Pontinen等[20]发现质粒pLM58编码的ClpL(热休克蛋白 HSP100亚家族)可提高宿主的耐热能力。Hingston等[5]发现Npx、Gbu前体、多金属转运ATP酶在单增李斯特菌质粒中较为多见，在6% NaCl和pH5.0条件下，质粒基因npx、cadA1、mco、clpL的表达水平显著增强，提示质粒的存在与抗酸和抗盐有关。Npx 和Gbu前体相邻存在，紧邻3个假设蛋白和1个多金属转运ATP酶，移动转座元件位于这整个区域的两端，提示这些基因具有可转移性和功能性。单增李斯特菌的环境适应能力极强，了解其在不良条件下的生存和持续存在机制对食品加工环境的污染控制至关重要。

2.3致病性 毒力相关质粒通常为大的(>40 kbp)低拷贝元件，编码促进宿主-病原体相互作用的基因[31]。毒力相关质粒的作用也不容忽视，是肠杆菌科引起人类腹泻的重要原因。Den Bakker等[32]首次报道单增李斯特菌潜在毒力相关质粒pLMIV上具有毒力相关的编码基因inlA、inlB、inlC和prf。Rychli等[33]发现该质粒的21 kbp片段(内化素家族)也在澳大利亚单增李斯特菌病暴发菌株的染色体上存在。细菌可能在长期进化过程将有利的基因从质粒转移到染色体上从而避免了维持质粒的成本[34]。Kropac等[19]运用斑马鱼胚胎模型证实质粒pLMST6可在一定程度提高宿主菌的毒力。G2组sub2亚组的质粒编码多种毒力相关基因，但这些基因是否发挥功能及其机制尚不清楚[5]。

2.4耐药性 目前全球的抗生素耐药性危机主要与质粒介导的抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes，ARG)传播有关[35-36]。关于中国单增李斯特菌质粒携带耐药基因的报道较少。但亦有报道单增李斯特菌质粒pNH1的转座子携带新型多重耐药基因簇，使其对多种抗生素耐药[22]。在食品、临床样本中检出多重耐药结合质粒pIP811、pLM78，其可在种内转移及跨属传播[23-24,37]。通过组学分析发现单增李斯特菌多个质粒携带多药外排泵EbrAB，具体功能尚未进一步研究，但在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中已证实此外排泵与溴化乙锭、丫啶黄抗性有关。有研究提示EbrAB多药外排泵在细菌的毒力、胆汁抗性、消毒剂抗性中发挥一定的作用[38-39]。一些多药外排泵，如单增李斯特菌外排泵ErmC[19]，通过分泌周期性di-AMP来触发受感染的巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素。单增李斯特菌耐药率较低，但质粒可作为食物链上耐药基因的储蓄池，李斯特菌属可通过来自肠球菌的质粒转移获得多重耐药性[24]。耐药基因的携带可使宿主菌对抗生素产生抗性，从而导致临床抗生素治疗无效，对微生物种群中质粒相关耐药机制的研究有利于积极应对抗生素耐药性的产生及流行。

2.5质粒基因的水平传播 基因可通过结合、转化、转导等水平传播(HGT)方式在细菌间进行转移。基因水平传播是细菌进化的重要驱动力，是细菌间传递抗性、毒力、耐药性，并使细菌获得新的生存特性的重要途径。质粒在复制或结合转移过程中可能发生基因序列的重排、删除或插入，导致质粒大小及功能的改变。在质粒进化过程中，质粒的功能基因亦可转移至染色体上，从而稳定的赋予宿主菌特定的功能。目前报道携带功能基因的单增李斯特菌质粒上IS插入序列、整合子较少，携带镉抗性基因的转座子Tn5422常见于单增李斯特菌质粒[40]。已有关于单增李斯特菌质粒结合转移的报道，如耐药质粒pLM78可转移至链球菌、耐药质粒pIP811可转移至粪肠球菌[23]，以及苯扎溴铵抗性质粒pLMST6可在单增李斯特菌间转移，并可能与致病性相关[19]。Ghigo等[41]研究发现结合质粒可促使生物膜的形成，提示结合性质粒可能是院内持续性感染的原因，同时增加了毒力因子在菌株间转移的风险。携带环境相关抗性基因的结合性质粒有助于宿主菌的生存，并可在种群中传播以维持宿主菌的持续存在，具有高毒力相关因子和多重耐药因子的结合性质粒的菌株是引起临床感染暴发的原因，因此具有重要的公共卫生意义。

3 展 望

质粒是微生物功能基因的储蓄池和传播者。目前对单增李斯特菌质粒的认识和研究中已明确功能的质粒基因并不多，许多质粒编码的假想蛋白基因还有待深入研究。有研究采用多种方法消除细菌中的质粒，可降低甚至消除细菌的耐药性，使细菌恢复对抗生素的敏感性，降低抗菌药物的用量，提高临床疗效，也是未来应对细菌耐药的策略之一[42-43]。能否研发一种有效的质粒消除方法应用于食品加工环境中的细菌，以清除持续性交叉污染的菌株，同时减弱携带毒力相关质粒菌株的致病性。尽管对单增李斯特菌质粒分布状况已有较全面的了解，但单增李斯特菌质粒的分类、功能和作用机制等仍有待进一步的研究。

利益冲突：无