皱盖假芝乙醇提取物的LC-MS/MS分析及其体外抗肿瘤活性

伍 燕， 吴德芳， 韦家美

(兴义民族师范学院 生物与化学学院， 贵州 兴义 562400)

0 引言

【研究意义】假芝(Amaurodermarugosum)属灵芝科假芝属，广泛分布于我国热带和亚热带地区，其子实体伤变后呈红色，故又叫血芝[1-2]。据《中国真菌志》第1版报道，假芝属在国内约有20种，主要分布在海南、广西、广东、福建、云南和贵州等地。假芝含有多种活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤等功效。我国野生假芝资源丰富，贵州西南部的册亨县、望谟县等地区每年6—10月均有大量假芝生长，但目前对当地假芝的药用功效缺乏了解，更未开发相关的保健产品。因此，研究当地假芝的药用功效对其开发利用具有重要意义。【前人研究进展】在假芝属中研究比较深入的有皱盖假芝(Amaurodermarude)、漆黑假芝(Amaurodermaexile)和假芝(Amaurodermarugosum)，其研究内容主要有资源分布、菌丝体发酵液的药理活性、子实体的醇提物、氯仿馏分和水提物活性等[3-8]。现代药理活性研究表明，假芝所含活性成分有真菌多糖、甾醇类、生物碱、挥发油、脂肪酸和酚类等，这些活性成分具有免疫调节作用、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和保肝护肝等功效[9-14]。【研究切入点】目前，受传统中医用药的影响，国内医药保健市场上灵芝相关产品常见的是赤芝和紫芝，对株型较小的假芝了解仅限于理论水平，市场上未见用假芝开发的产品，因此，对野生假芝子实体的推广和利用有着巨大的发展空间。【拟解决的关键问题】对采自贵州的野生假芝进行形态学和分子生物学鉴定，用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)对假芝菌丝体进行分离纯化，对其一级菌丝体的可栽培特性进行研究；采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测野生假芝子实体醇提物的主要成分，并用不同极性溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次对假芝的乙醇浸膏进行萃取，采用MTT法检测不同极性溶剂提取物对人类肿瘤细胞HCT-116和HepG2增殖的抑制作用，以期为深入了解贵州野生假芝的可培养特性、醇提物主要成分和抗肿瘤活性，以及开发利用贵州野生假芝提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生假芝：采集自贵州省册亨县野生板栗树下，采集地海拔约879 m。

肿瘤细胞：人肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HCT-116，均由广西民族大学惠赠。

试剂：DMEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、5-氟尿嘧啶、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，国药集团。

仪器设备:UPLC-QTOF-MS/MS，美国Waters公司；Thermo Scientific Multi-skan FC酶标仪，美国赛默飞公司；ECLIPSE TS100倒置相差显微镜，日本Nikon公司；YXQ-SL-100G高压蒸汽灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；DHJ-9246A精宏电热干燥鼓风箱，上海精宏仪器设备有限公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州尚田洁净技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 假芝子实体的分子生物学鉴定和形态学鉴定 将野生子实体培养成菌丝，取菌丝0.5 g，用改良的CTAB法提取基因组DNA[15]，通用引物ITS1和ITS4扩增其ITS序列，送深圳华大测序获得ITS序列，经Chromas检测后在Gen Bank中Blast N进行比对，下载相关序列用Mega 6.01建树分析，分子鉴定后将ITS序列提交到GenBank获取基因登录号。形态鉴定按《中国灵芝科真菌资源与分布》进行。

1.2.2 假芝不同溶剂萃取物的制备 野生假芝子实体500 g干燥粉碎，按料液比1∶10加入95%乙醇，微波超声30 min，4℃浸泡24 h，80℃水浴回流提取1 h，3次重复，合并乙醇提取液，50℃真空减压浓缩得浸膏12.16 g；加适量水溶解浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，50℃减压浓缩各部分萃取液，得石油醚提取物2 g、乙酸乙酯提取物0.5 g及正丁醇提取物0.3 g。

1.2.3 假芝醇提物的LC-MS/MS成分分析色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相A为0.1%甲酸-水；B相为乙腈。梯度洗脱程序：在0～6 min 内，B相由10%溶液逐渐升至45%溶液；在6～12 min内，由45%升至90%；在12～15 min内，由90%降至10%。洗脱程序中流速为0.5 mL/min，柱温为35℃，进样体积为20 μL。

质谱条件：正离子模式(ESI+)，电压为4.0 kV；负离子模式(ESI-)，电压为3.5 kV[16]。

1.2.4 MTT法检测假芝不同溶剂提取物的抗肿瘤活性 将不同极性的乙醇、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物用DMSO配成20 mg/mL待用，HepG2和HCT-116细胞用DMEM(含10%FBS血清)培养至对数期，用血球计数板计数，调整细胞浓度至1×105个/mL，吸取100 μL接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养24 h。用无血清的DMEM培养基稀释20 mg/mL的提取物至终浓度为12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，将96孔板中的细胞培养液吸出，向培养细胞中加入100 μL各浓度提取物，对照组和空白组均加等量的无血清培养基[17]。每处理设5个重复。培养48 h后，弃上清液，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续培养4 h，再每孔加入DMSO 100 μL，充分振荡10 min，于酶标仪490 nm下检测吸光值A。按公式计算IC50值：

抑制率 =1-试验组平均值A490/ 对照组平均值A490。

1.2.5 数据处理 Excel 2010统计数据，MassLynx 4.1分析质谱数据，Graphpad Prism 5计算IC50半浓度效应抑制率。

2 结果与分析

2.1 假芝菌株的生物学特征及分子鉴定

从图1可知，野生假芝子实体的菌盖呈伞形至近圆形，直径3～8 cm，厚 0.5～1.04 cm，与菌柄同色，具显著同心环纹，无似漆样光泽，边缘钝、薄。菌丝形态：初生菌丝新鲜时呈白色，随着培养时间延长，由中心向边缘逐渐变深褐色，菌丝断裂处变红色，并逐渐转化为褐色，有明显色变现象，野生假芝的菌丝体很容易在PDA培养基上分离纯化和培养。孢子形态：担孢子形状为椭圆形，双层壁，外壁无色透明，平滑，内壁淡黄褐色，有微小刺，孢子大小为(1～3)μm ×(10～15)μm，符合皱盖假芝形态特征。从图2可知，册亨假芝以100%的支持率与假芝Amaurodermarugosum(KJ654362)处于同一分支，从分子生物学鉴定该菌属于假芝属的假芝。

注：A为子实体， B为菌落形态特征，C为菌株产孢结构，D为孢子。

图2 菌株MG021113基于ITS序列构建的进化树

2.2 假芝醇提物的LC-MS/MS成分

从表1可知，通过LC-MS/MS出峰图谱顺序，正离子模式下检出11种物质，其中1种为星鱼甾醇，1种为脂肪酸，9个为未知物质；负离子模式下检出19种化合物，其中1种为原儿茶酸，10种为脂肪酸，8种为未知物质。

表1 皱盖假芝的LC-MS/MS出峰成分

2.3 假芝不同溶剂萃取物对细胞HCT-116和HepG2增殖抑制的IC50值

从表2可知，假芝不同溶剂萃取物对结肠癌细胞HCT-116增殖具有不同程度的抑制作用，其抑制率随着提取液浓度的增加而增大。经计算，假芝石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物的IC50值分别为156.60 μg/mL、1 183.00 μg/mL和136.20 μg/mL，其抑制活性依次为正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物，根据IC50值越小抑制效率越高，抑制结肠癌细胞HCT-116增殖表现最好的是正丁醇萃取物。

同样，假芝不同溶剂萃取物对肝癌细胞HepG2增殖具有不同程度的抑制作用，假芝石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取的IC50值分别为69.85 μg/mL、121.10 μg/mL和98.77 μg/mL，其抑制活性依次为石油醚萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物，根据IC50值越小抑制效率越高，抑制肝癌细胞HepG2增殖最好的是石油醚萃取物。

表2 不同极性提取物对HCT-116和HepG2增殖的抑制作用

3 讨论

对产自贵州西南地区的皱盖假芝进行纯培养和分离鉴定，提交其ITS序列到NCBI获得基因号MG021113，一级菌丝经PDA分离，长势良好。肖自添等[18]对广州分离到的野生假芝菌丝研究结果表明，液体菌种培养5 d即可用于生产，贵州分离到的皱盖假芝可栽培特性也表现良好，可用于规模化生产。皱盖假芝子实体经过粉碎和乙醇提取有效成分，相色谱液-串联检测发现，在正离子模式下检出11种主要化合物，在负离子模式下检出19种化合物，此2种模式下能确定分子结构的化合物有星鱼甾醇和原儿茶酸，可鉴定成分以脂肪酸为主，还有部分未知化合物不能确定结构。李向敏[19]对皱盖假芝孢子粉的醇提取物氯仿部分离获得2种具有抗肿瘤活性的脂肪酸、棕榈酸和二十碳酸，通过液相色谱-串联质谱法获得的成分大部分也是脂肪酸，说明脂肪酸在药理活性中具有重要的活性作用，未来可深入研究其机理作用。同时，皱盖假芝不同溶剂提取物采用MTT法对2株肿瘤细胞检测发现，石油醚提取物对人肝癌细胞HepG2生长具有良好抑制活性，其IC50值为69.85 μg/mL；正丁醇提取物对人结肠癌细胞HCT-116增殖抑制作用好，其IC50值为132.6 μg/mL，可见，皱盖假芝虽然不含灵芝科特有的活性成分灵芝酸，但对肿瘤细胞生长仍具有不同程度的抑制作用。

4 结论

贵州黔西南地区所产野生皱盖假芝可在实验室分离纯化，可栽培性表现良好；子实体的醇提物经LC-MS/MS分析，主要成分为脂肪酸。假芝子实体用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取后经MTT法检测，均对人类肿瘤细胞HCT-116和HepG2增殖具有不同程度的抑制作用。该结果为贵州野生皱盖假芝的进一步开发利用提供了基础。