羰基化合物腙衍生物的高分辨质谱碎裂行为

李利荣，李晓熙，刘殿甲，吴宇峰，关玉春，张肇元

(1.天津市生态环境监测中心，天津 300191；2.南开大学人工智能学院，天津 300350)

液相色谱-大气压电离-离子阱质谱(HPLC-API-IT-MS)最早用来进行化合物结构解析，Michal等[1]总结并解释了HPLC-API-MSn技术分析带有典型基团的小分子化合物的基本碎裂规律。电喷雾离子源(ESI)技术的发展成功解决了HPLC和MS联用的接口问题，使HPLC-MS逐渐发展为成熟的技术。该技术不仅适用于分析各种有机小分子化合物，还可以使生物聚合物、蛋白质等不耐热、极性大和高分子质量的化合物电离并转移到气相，从而将其应用于分子生物学、医学和植物代谢组学[2-4]等领域。Daniel等[5]研究了在ESI正、负离子模式下，某些典型合成产物和天然产物最常见的碎裂规律。2000年，俄罗斯科学家Makarov等[6-7]根据静电场轨道阱技术提出了Orbitrap作为一种新型质量分析器，其质量精度<1×10-6，大幅提高了未知物确证的准确度。近年来，采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)结合碰撞池(HCD)或其他碎裂方法促进化合物裂解进行结构解析的报道显著增加[5]。

醛酮类羰基化合物(CC)是空气中一类重要的环境污染物，是形成空气中多种自由基、有机酸、臭氧、过氧酰基硝酸酯(PAN)和二次有机气溶胶(SOA)等污染的重要前体物，是光化学烟雾的主要成分[8-13]。测定环境介质中CC的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和分光光度法(SP)等，而液相色谱-质谱法(LC-MS或LC-MS/MS)在定性方面的优势大大提高了CC检测的准确性。Kolliker等[14-16]在大气压化学电离源(APCI)负离子模式下，通过离子阱质谱法分析了部分羰基化合物腙衍生物(CC-DNPH)的碎片结构，但受限于当时仪器精度水平，部分碎片可能存在解析偏差。目前，Orbitrap高分辨质谱优异的质量精度和超高分辨率为CC-DNPH的碎裂机理研究提供了可靠的基础。

本文拟利用高效液相色谱-电喷雾-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-ESI-Q-Orbitrap MS)对25种CC-DNPH的结构进行解析，系统研究CC-DNPH的质谱碎裂规律，建立快速筛查数据库，并将其用于环境空气样品的筛查及定量分析。根据裂解规律、母离子和子离子精确质量，扩展筛查其他可能存在的羰基化合物，希望为环境多种介质中CC筛查检测提供方法参考，为环境安全监测、预警和执法提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Ultimate 3000-Q Exactive Focus超高效液相色谱-电喷雾-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司产品；Cleanert DNPH-Silica醛酮气体采样管(200 mg/3 mL)及臭氧去除管(240 mg/3 mL)：天津艾杰尔飞诺美公司产品；0.22 μm尼龙水相针式滤膜：美国Supelco公司产品。

1.2 材料与样品

25种CC-DNPH标准溶液(15 mg/L)：美国ChemTek公司产品；2,4-二硝基苯肼(DNPH)：纯度99.5%，百灵威公司产品；乙腈：色谱纯，德国Merk公司产品；超纯水：经Milli-Q超纯水系统纯化制得。

1.3 分析条件

1.3.1色谱条件 Thermo Accucore RP-MS色谱柱(2.1 mm×100 mm×2.6 μm)；柱温40 ℃；流动相：A为1 mmol/mol乙酸铵-水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～5 min(50%B)，8～15 min(50%～60%B)，15～20 min(60%～70%B)，20～24 min(70%～80%B)，24～25 min(80%～95%B)，25～28 min(95%B)，28～28.1 min(95%～50%B)，28.1～30 min(50%B)；流速0.3 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2质谱条件 HESI电离源，负离子模式；毛细管温度325 ℃；离子源加热温度350 ℃；喷雾电压2 800 V；透镜电压60 V；一级质谱Full MS和平行反应监测(PRM)参数：分辨率70 000，最大容量(AGC target)1×106，最大驻留时间(maximum IT)100 ms，质量扫描范围m/z50～600；二级质谱dd-MS2参数：分辨率17 500，归一化碰撞能量(NCE)(45±20) V，最大容量2×105，最大驻留时间60 ms，动态排除8.0 s。

1.3.3数据处理 采用Trace Finder 3.3软件处理数据。一级母离子精确相对分子质量参数：峰强度阈值10 000，信噪比阈值5.0，质荷比允许偏差5.00×10-6，保留时间允许偏移30 s；二级子离子参数：最少匹配数1个，峰强度阈值5 000，质荷比允许偏差5.00×10-6。定量方法：基于目标分析物的一级母离子峰面积，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

2.1.1离子模式的选择 实验比较了ESI正、负离子模式下Full MS-ddMS2的准分子离子峰及其碎片离子。结果发现，在负离子模式下，25种CC-DNPH生成了高响应值的准分子离子峰[M-H]-；而在正离子模式下，虽然存在明显的[M+H]+峰，但各目标物的响应值均较低。正、负离子模式下，300 μg/L标准溶液中各化合物的母离子(准分子离子峰)响应值示于图1。可见，负离子模式更适用于CC-DNPH的检测。

注：FA.甲醛-DNPH；AA.乙醛-DNPH；ACR.丙烯醛-DNPH；AK.丙酮-DNPH；2-FA.糠醛-DNPH；PA.丙醛-DNPH； CA.丁烯醛-DNPH；BK.丁酮-DNPH；MA.甲基丙烯醛-DNPH；BA.丁醛-DNPH；BZA.苯甲醛-DNPH；IVA.异戊醛-DNPH； CHK.环己酮-DNPH；GA.戊二醛-DNPH；VA.戊醛-DNPH；TA.甲基苯甲醛-DNPH；MIBK.甲基异丁基酮-DNPH； HEXA.己醛-DNPH；DMBA.2,5-二甲基苯甲醛-DNPH；HEPA.庚醛-DNPH；OA.辛醛-DNPH；NA.壬醛-DNPH；DA.癸醛-DNPH图1 正、负离子模式下，CC-DNPH准分子离子响应丰度Fig.1 QMIs abundance of CC-DNPHs at positive and negative ion modes

2.1.2不同碰撞能量对碎片生成的影响 本实验检测了在负离子模式下，NCE均值分别为20、30、40、45、50、60、80 V时，25种目标物的母离子和子离子响应。结果表明，在相同的碰撞能量下，饱和脂肪醛的母离子峰响应均低于碎片离子，更容易碎裂，其他醛酮类(如芳香醛、不饱和脂肪醛以及酮类)母离子的响应均较高，要达到相当的碎裂程度，则需要更大的碰撞能量；同一种物质在不同的碰撞能量下，[M-H]-及其碎片离子的相对响应变化较大，能量越大，[M-H]-离子峰丰度越小。在NCE均值>30 V时，甲醛和戊二醛的母离子全部碎裂；NCE均值>50 V时，有将近一半化合物的母离子全部碎裂；NCE>70 V时，只有对-甲基苯甲醛、糠醛、壬醛和癸醛可见响应非常低的母离子，其他全部碎裂。因此，本研究选择甲醛和戊二醛NCE均值为30 V，其他醛酮类NCE均值为45 V对化合物进行二级质谱分析。

2.2 化合物母离子和子离子信息

对25种浓度为150 μg/L 的CC-DNPH混合标准溶液，以PRM方式获得目标物的保留时间、母离子和碎片离子精确质量数等，建立快速筛查数据库，具体信息列于附表1(请登录《质谱学报》官网http：∥www.jcmss.com.cn下载)。在优化的色谱条件下，25种目标物中只有对-甲基苯甲醛和间-甲基苯甲醛共流出，其他均可达到至少50%分离度，可以获得准确的目标物信息。25种目标物母离子及其子离子的质量准确度误差均小于5×10-6，表明目标物的质量准确度良好，可以满足化合物结构解析及筛查需求。典型的CC-DNPH二级质谱图示于图2。

2.3 CC-DNPH结构解析

通过分析2,4-DNPH和25种CC-DNPH母离子及其二级碎片离子，饱和脂肪醛与非饱和脂肪醛、脂肪醛与芳香醛、单羰基醛与二羰基醛及呋喃甲醛碎片离子存在较大差异，而m/z76[C5H2N]碎片离子存在于所有目标物二级质谱图中，且分子质量越小的化合物，m/z76相对响应越高。如饱和脂肪醛中，甲醛相对响应最高的碎片离子为m/z76，乙醛、丙醛和丁醛为m/z122，其他为m/z152。2,4-DNPH裂解碎片较独特，基峰为m/z137，峰高其次为m/z167，相对响应约为70%，这两个离子在25种CC-DNPH碎片中均未发现，表明2,4-DNPH裂解路径与CC-DNPH不同。甲醛与其他醛类的碎裂离子相差较大，如相对响应较高的m/z133碎片离子只存在甲醛中，m/z120的相对响应在甲醛碎片离子中较高，而在其他化合物离子碎片中较低。25种CC-DNPH除了响应高的碎片离子，还有响应不高但具有明显中性丢失及特征碎片脱落的离子，如中性丢失18 u[H2O](丁醛、己醛和庚醛和酮)；具有相同脱落的特征碎片，如30 u[NO](除甲醛、丙烯醛和甲基丙烯醛外的脂肪醛和酮)、31 u[HNO](丙烯醛、丁烯醛和丙烯醛)、45 u[CH3+NO] (丁烯醛、甲基丙烯醛和己醛)、46 u[H2N2O](甲醛、乙醛和丙烯醛等)、47 u[HNO2](甲醛、丙烯醛和丙酮等)、59 u[HN3O](丙酮、丙烯醛和丁酮等)、60 u[N2O2](丙烯醛、丙酮和丁醛等)、65 u[H3NO3](丙烯醛和丁烯醛)、76 u[H2N3O2](甲醛和DNPH)、77 u[HN2O3](丙烯醛、丁烯醛和甲基丙烯醛等)、78 u[H2N2O3] (丁烯醛、丁酮和丁醛等)、93 u[H3N3O3](苯甲醛和2,5-二甲基苯甲醛)、165 u[C6H3N3O3](丙酮、丙烯醛、丁烯醛等)等。

注：a.2,4-硝基苯肼；b.甲醛-DNPH；c.丙酮-DNPH；d.2,5-二甲基苯甲醛-DNPH图2 负离子模式下，典型的CC-DNPHs二级质谱图Fig.2 MS/MS spectra of typical CC-DNPHs at negative mode

此外，m/z163碎片结构解析结果与文献[14-16]报道的C7H5N3O2(精确质量数为m/z163.038 18)不同，为C6H3N4O2(精确质量数为m/z163.025 60)。某些中性丢失、裂解机理与文献[17]报道不同，如25种目标物和DNPH质谱碎片中均未见m/z17[NH3]的中性丢失碎片，表明未发生完整的费舍尔吲哚反应。所有化合物m/z181碎片离子相对响应均高于m/z182，近一半化合物质谱图中未发现明显的m/z182碎片离子。根据25种[M-H]-碎片精确质量数及其在二级质谱图中的相对响应，推测主要碎片离子可能的结构及碎裂过程，示于图3。

2.3.12,4-二硝基苯肼裂解规律 2,4-DNPH的特征二级碎片离子为m/z137、167、179、138等，在其他CC-DNPH中的响应都较低，甚至检测不到，其可能的裂解规律示于图4。

2.3.2饱和脂肪醛裂解规律 甲醛分子质量相对较小，在相同的碎裂电压下，碎片碎裂程度相对较高，主要碎片离子的分子质量也较小，基峰为m/z76，其次为m/z133。特征碎片m/z133[C7H3NO2]-可能的裂解规律示于图5。其他饱和脂肪醛遵循[M-H]-→m/z182→m/z152→m/z122和[M-H]-→[M-H-H2O]-→m/z179→m/z163的裂解规律，响应最高的特征离子主要为m/z152、122、163等，大于等于5个碳的醛的腙衍生物分子质量越大，m/z152相对丰度越高，分子质量越小，m/z122丰度越高。大多数具有丢失30、60[N2O2]、165、59和78 u碎片，大于4个碳的醛的衍生物均带有18 u中性丢失。

由于直链和支链醛或酮发生化学反应的活性不同，探究它们的碎裂规律具有重要意义，但直链和支链醛或酮的物理化学性质相似，容易发生共流出。由于供研究的直链、支链目标物数量较少，需要进一步研究更多结构以获得丰富的信息。本研究涉及到的直链和支链醛为戊醛/异戊醛、丁烯醛/甲基丙烯醛，在优化的色谱条件下均能实现分离。戊烷和异戊醛具有非常相似的裂解规律。甲基丙烯醛和丁烯醛碎片差异较大，虽然二者基峰均为准分子离子峰，但甲基丙烯醛具有相对响应约50%的m/z79[C4H3N2]-峰，而丁烯醛没有，这可能是由于甲基丙烯基和2个N从母离子上碎裂下来后，发生了分子重排而生成环状结构；丁烯醛有较高丰度的m/z181碎片，相对响应约70%，而甲基丙烯醛m/z181碎片峰的丰度则低于m/z79和163，约为40%。根据丁烯醛和甲基丙烯醛m/z205[C10H9N2O3]-碎片的精确质量数60，推断碎片丢失不应为[N2O2]，而是[CH4N2O]，丁醛存在类似的裂解规律。

2.3.3不饱和醛裂解规律 不饱和醛包括丙烯醛、丁烯醛、甲基丙烯醛等3种脂肪醛和以糠醛为代表的呋喃醛。在碰撞能量45 V下，丙烯醛和糠醛的母离子响应均较高，一般为基峰，说明在相同的碰撞能量下不饱和醛比饱和醛更难碎裂。碎片离子中，m/z152和122比m/z163、181、76、179丰度低，表明存在[M-H]-→m/z182→m/z152→m/z122、[M-H]-→[M-H-H2O]-→m/z179→m/z163以及[M-H]-→m/z181的裂解路径，且[M-H]-→m/z122的碎裂发生相对较少。不饱和醛均未发现18和30 u的碎片丢失。糠醛只表现47 u的碎片丢失，其他3种醛存在31和47 u的碎片丢失。此外，丙烯醛还存在46、60、65和77 u的碎片丢失，丁烯醛和甲基丙烯醛均存在45和165 u的碎片丢失，甲基丙烯醛存在77 u的碎片丢失，丁烯醛存在46、65、78 u的碎片丢失。

图3 CC-DNPH母离子形成示意图(a)和主要碎片可能的离子结构及形成过程示意图(b)Fig.3 Schematic of [M-H]- of CC-DNPHs (a) and main possible fragment structures and fragmentation pathways of CC-DNPHs (b)

图4 2,4-DNPH主要碎片离子结构及形成过程示意图Fig.4 Main fragment structures and fragmentation pathways of 2,4-DNPH

图5 甲醛-DNPH m/z 133碎片结构及形成过程示意图Fig.5 Structure and fragmentation pathway of m/z 133 of formaldehyde-DNPH

2.3.4芳香醛裂解规律 本研究的芳香醛包括苯甲醛、甲基苯甲醛和2,5-二甲基苯甲醛。芳香醛均含有较高丰度m/z181、163、76、120、122、151、135、105以及48 u[H2NO2]丢失的碎片。77、93和165 u碎片丢失的离子在苯甲醛中有中等强度的相对响应。芳香醛均含有特征碎片m/z164[C6H3N3O3]-、m/z104[C7H6N]-及中性丢失28 u[N2]，但相对响应均不足10%。N2丢失的可能裂解规律示于图6。m/z121碎片在苯甲醛中的相对响应约为70%，在甲基苯甲醛和2,5-二甲基苯甲醛中的相对响应不足10%。m/z148仅存在于2,5-二甲基苯甲醛碎片中，其他两种化合物不含该碎片。

2.3.5酮裂解规律 酮包括丙酮、丁酮、环己酮和甲基异丁基酮。所有酮-DNPH的质谱图中均含有[M-H-H2O]-和[M-H-NO]-峰，即均有18和30 u丢失碎片，其中30 u丢失碎片响应较高，但相同分子质量的醛m/z30碎片响应则相对较低。酮-DNPH与其同分异构体的醛-DNPH相比，酮-DNPH有较高丰度的m/z122、152、178峰，缺少或虽含有但相对响应低于5%的m/z163峰。丁酮、环己酮和甲基异丁基酮含有m/z76和181碎片峰，但相对响应均低于10%。表明[M-H]-→m/z182→m/z152→m/z122和m/z178的生成过程为主要裂解路径。丙酮、丁酮和甲基异丁基酮均存在m/z178[C9H8NO3]-特征碎片。m/z178可能发生的碎裂过程示于图7。

2.3.6二醛和呋喃醛裂解规律 二醛和呋喃醛包括戊二醛和糠醛(2-呋喃甲醛)。戊二醛结构稳定性较差，在NCE平均值为30 V时，戊二醛母离子的相对响应约为基峰m/z182[C6H4N3O4]-的75%；当CE为40 V时，不存在母离子，质荷比最大的子离子为m/z279[C11H11N4O5]-碎片，其次为m/z163、122、152、76、197、233和179等碎片离子。m/z197和179在其他24种目标物中均响应极低或未发现，而在DNPH中明显存在。

R=aromatics, furan, naphthenic图6 芳香醛N2中性碎片丢失过程示意图Fig.6 Schematic diagram of N2 neutral debris loss process of aromatic aldehydes

图7 m/z 178碎片结构及形成过程示意图Fig.7 Structure and fragmentation pathway of m/z 178

糠醛中仅发现47 u[HNO2] 碎片离子，且相对响应约为50%。m/z182相对响应约为m/z181的80%，而其他24种目标物碎片中m/z182相对响应均较低。糠醛碎片中主要碎片离子相对响应从高到低依次为m/z76、181、163、228、182、151等，表明糠醛-DNPH较易碎裂，主要碎裂路径为[M-H]-→[M-H-H2O]-→m/z179→m/z163、[M-H]-→m/z181→m/z151以及[M-H]-→m/z182。

2.4 实际样品分析

应用本方法分析分别于2020年1月27日、3月9日、3月15日、3月21日、3月27日在天津市区采集的5个环境空气样品，针对25种羰基化合物进行定性和定量测定。结果表明，在5个实际样品中，除戊二醛外，其他24种目标物的平均浓度在0.006～4.45 μg/m3之间。

对5个样品中13种其他可能存在的非靶标羰基化合物进行筛查，发现m/z152、122、163等主要碎片离子遵循与解析结果相似的裂解规律。根据结构相似化合物的响应因子，推测12种阳性化合物(4′-甲氧基苯乙酮筛查结果为阴性)的半定量浓度在0.007～4.18 μg/m3之间，其中2-壬酮浓度最高，其次为十二醛、十三醛和十一醛，均大于1.0 μg/m3。12种阳性化合物的保留时间、精确质量数、子离子及半定量结果列于表1。

3 结论

本研究利用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法解析了25种CC-DNPH的质谱裂解规律，阐述了饱和脂肪醛、不饱和脂肪醛、芳香醛、二羰基醛和酮等DNPH衍生物在二级质谱中的裂解规律，并建立了可用于准确定性的筛查质谱库。将本方法用于5种实际样品的检测，并扩展筛查了13种其他可能存在的羰基化合物，根据结构相似化合物的响应因子，推测了12种阳性化合物的半定量结果。本研究可为小分子极性化合物质谱裂解规律解析提供借鉴。