元素分析-同位素质谱联用测定微量氮元素同位素方法研究

尹希杰，刘维维，王永涛,2，苏 静，李廷伟

(1.自然资源部第三海洋研究所，信息与测试保障中心，福建 厦门 361005； 2.河南理工大学资源环境学院，河南 焦作 454000；3.中国科学院青海盐湖研究所，青海 西宁 810008)

氮是生命活动的主要元素之一，对各类生命体、食物链、生态系统甚至整个生物圈功能的实现都起着不可或缺的作用。在科学探究全球氮循环方面，自然环境中存在的氮稳定同位素具有重要的地位和作用[1]，因同位素具有示踪、整合和指示等功能，以及检测快速、结果准确等特点，在自然科学研究中展现出日益广阔的应用前景，如生态学研究、植物生理分析和食品检测等[2-6]。

目前，测定固体样品中总氮含量的常用方法有凯式蒸馏法和元素分析高温燃烧还原法[7-8]。氮稳定同位素分析主要采用元素分析-同位素质谱(EA-IRMS)联用的高温氧化还原在线测定技术，与传统的真空热解法和次溴酸氧化离线法制样测定氮同位素相比，EA-IRMS具有高效、便捷的优点，简化了前处理过程，降低了人为操作误差，是测定固体样品总氮含量及其稳定同位素比值的通用方法[9]。但元素分析仪载气流速通常大于100 mL/min，而稳定同位素质谱通常需要真空度在10-8MPa以上，进入质谱离子源的气体流速仅约0.1 mL/min。EA-IRMS联用技术需要对进入质谱的载气进行较大比例地稀释，导致样品检出限较高，极大限制了该技术对低含氮量固体样品的测试。

EA-IRMS测试氮同位素δ15N值时，当标准偏差满足0.2‰(n=6)的要求，氮元素的质量一般须大于20 μg，而当元素分析仪的固体包样量超过30 mg，样品中氮元素在氧化管中难以被瞬间充分氧化，导致谱图存在明显拖尾现象，使氮含量的测试结果偏低并产生同位素分馏。一些固体样品(如岩石粉末、海洋沉积物和贫瘠的土壤)中的氮含量较低(低于0.07%)，采用EA-IRMS联用技术测试这些样品难以获得理想的结果。粟敏等[10]发现在测试氮同位素时，尤其对低含氮量样品，进样量会直接影响实验结果，只有当进样量达到一定量以后，氮同位素的测试值才能接近准确值，最终数据表明，测试样品中绝对含氮量为30～50 μg时，结果偏差最小，所测得的氮同位素最可靠[10]。受实验条件的限制，目前典型沉积环境中低含氮量的烃源岩及原油样品的测试数据极少，对沉积有机质的氮同位素研究较薄弱，关于氮同位素的测试条件和分析方法的报道较少。

为解决低含氮量样品难以测试氮同位素这一问题，本研究拟通过改变氧化管、还原管和除水管的管径，优化色谱柱条件，减小载气流速，并保持氮气色谱图峰形基本不变，实现降低目标气体的稀释度，进而提高EA-IRMS对氮气的检出限。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

EA-IRMS分析系统主要由Sercon iso Earth型元素分析仪和Sercon HS20-22同位素比值质谱仪组成；元素分析仪主要由66孔旋转木马式的气动自动进样装置、氧化柱、还原柱、吸水柱和分离柱等部分组成；氧化柱自上而下依次填充有氧化铬、氧化铜和镀银氧化钴；还原柱自上而下依次填充有石英碎屑和线状还原铜；吸水柱填充高氯酸镁；包裹固体样品用的锡杯为5 mm×8 mm；梅特勒百万分之一电子天平；载气He(纯度>99.999%)，助燃气O2(纯度>99.999%)，参考气N2(纯度>99.999%)。

1.2 样品与试剂

氮同位素的标准物质有IAEA-600(咖啡因)：δ15N=1‰；实验室标准乙酰苯胺(ACET)：δ15N=1.18‰。

沉积物样品采自某市滨海湿地公园，首次测试后发现其含氮量低于0.1%，属于低含氮量样品。

1.3 实验方法

用锡杯包好称重的样品，在He氛围下经自动进样器送入高温氧化管，1 000 ℃氧气氛围中瞬间氧化生成多种成分的混合气体，固体样品中的氮元素被氧化，随后在600 ℃下氮的氧化物被还原铜还原成N2，生成的氮气和其他气体通过化学阱除去水分，再经色谱柱分离，进入热导检测器(TCD)测定氮含量，少量氮气进入同位素比值质谱仪中，测定氮稳定同位素比值。

1.4 样品前处理及测试流程

用研钵研磨风干的固体样品，过100目筛，常温下干燥保存。根据样品中的含氮量，用百万分之一天平准确称量样品粉末，用锡箔杯紧密包裹成球状，并按样品编号依次放入96孔板中。将包裹好的标准物质和样品放入元素分析仪的自动进样器中，前5个孔不放(测量空白)，然后按照合适的间隔放置标准品和样品。在开始、中间和末尾都要放置实验室标准品，用来校正仪器测试过程中的漂移。

2 元素分析仪优化改装

2.1 优化前元素分析仪配件规格

元素分析仪优化前，氧化管、还原管的石英玻璃管的规格一致，外径20 mm，内径16 mm，长48 cm；除水阱内径10 mm；色谱柱内径4.8 mm，填料类型为Carbosieve G，60～80目，长40 cm。具体配置示于图1。

2.2 优化前测试条件

氧化柱温度1 000 ℃，还原管温度600 ℃，色谱柱温度60 ℃；He压力117 kPa，流速80 mL/min；O2压力124 kPa，流速100 mL/min，加氧时间20 s。

图1 优化前元素分析仪的配置Fig.1 Element analyzer configuration before modified

2.3 优化后元素分析仪配件规格

氧化管上半部分和优化前用的石英玻璃管内径一致，内径16 mm，长24 cm，其中放置的灰分管规格与优化前的一样，下半部分管径变细，内径8 mm，长19 cm，用于填充氧化剂(Cr2O3和CuO)和镀银氧化钴(Co3O4Ag)；还原管外径6 mm，内径4 mm，长48 cm；色谱柱内径2 mm，填料类型为Carbosieve G，60～80目，长50 cm。具体配置示于图2。

2.4 优化后测试条件

氧化柱温度1 050 ℃，还原柱温度640 ℃，色谱柱温度60 ℃；He压力207 kPa，He流速20 mL/min；O2压力214 kPa，O2流速40 mL/min，加氧时间10 s。

图2 优化后元素分析仪的配置Fig.2 Element analyzer configuration after modified

2.5 方法评价

2.5.1精密度 分别称取约0.2 mg和0.04 mg乙酰苯胺标准品各6份，紧密包裹于锡杯中，用优化前、后的仪器条件分别进行测试，对比2次测试结果，评估优化后EA-IRMS的稳定性。

2.5.2氮含量和同位素线性 仪器优化前，分别称取约0.03、0.06、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mg乙酰苯胺标准品各3份，根据热导检测器测定的积分面积与乙酰苯胺中氮元素的质量绘制相关曲线和氮同位素比值随氮元素质量变化的趋势图。优化后，分别称取约0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1 mg乙酰苯胺各3份，上机测试，根据测试结果绘制相关曲线和趋势图。

2.5.3低含氮量沉积物氮同位素的测试 仪器优化后，选取某低含氮量(氮含量约0.09%)的沉积物样品，分别称取5、10和15 mg样品各4份，紧密包裹于锡杯中，上机测试。

3 结果与讨论

3.1 优化前氮元素及同位素响应范围

图3 优化前乙酰苯胺中氮质量 与TCD峰面积的线性曲线Fig.3 Linear curve of nitrogen quality in acetanilide and peak area detected by TCD before modified

乙酰苯胺质量(x)与仪器TCD检测器峰面积(y)的线性曲线示于图3，氮元素在2～120 μg质量范围内与积分面积呈线性关系，线性方程为y=1.17x-3.42，相关系数R2=0.999。氮同位素δ15N值随氮元素质量变化的测定结果示于图4。当氮元素质量≥20 μg时，δ15N测试值基本处于虚线范围内，即δ15N值的标准偏差范围在0.2‰以内；当氮质量<20 μg时，其δ15N测试值大部分处于虚线范围外，标准偏差范围扩大至0.9‰～1.83‰之间。由此表明，样品中氮元素的绝对质量大于20 μg时，才能得到准确结果。

3.2 优化前的精密度

称取约0.2 mg乙酰苯胺，连续测定6次，结果列于表1，6次测试结果的标准偏差(STD)为0.133‰，表明仪器精密度良好。乙酰苯胺δ15N的真实值为1.18‰，6个平行样的测试值和真实值的标准偏差均小于0.2‰，符合测试标准。

注：实线表示乙酰苯胺中氮同位素的真实值； 虚线表示±标准偏差0.2‰的值图4 优化前δ15N值随氮质量变化趋势Fig.4 Variation trend of δ15N with nitrogen quality before modified

表1 乙酰苯胺精密度测试结果Table 1 Precision test results of acetanilide

图5 优化后乙酰苯胺中氮质量与TCD峰面积线性曲线Fig.5 Linear curve of nitrogen quality in acetanilide and beam area detected by TCD after modified

3.3 优化后氮元素及同位素响应范围

注：实线表示乙酰苯胺中氮同位素的真实值； 虚线表示±标准偏差0.2‰的值图6 优化后δ15N值随氮元素质量变化的趋势Fig.6 Variation trend of δ15N with nitrogen quality after modified

优化后乙酰苯胺氮质量(x)与仪器TCD检测器测定峰面积(y)的线性曲线示于图5。可见，氮元素在1～120 μg质量范围内与积分面积呈线性关系，线性方程为y=3.99x+0.36，相关系数R2=1。氮同位素δ15N值随氮元素质量变化的测定结果示于图6。当氮元素质量小于4 μg时，δ15N测试值有部分落在虚线范围外，标准偏差范围增加至0.39‰～0.76‰之间；当氮元素质量处于4～80 μg时，δ15N测试值基本处于虚线范围内，即δ15N值的标准偏差范围在0.2‰以内，其中当氮元素在4～40 μg质量范围内时，氮同位素测试的平行性及准确性都能达到仪器测试要求，当氮质量大于40 μg时，虽然平行性能满足0.2‰的要求，但由于固体样品中氮元素氧化还原效率较低或色谱柱过载等因素，导致氮同位素产生分馏，测试结果趋于贫化，准确度降低。所以，优化后EA-IRMS仪器测定固体样品中氮元素质量最好处于4～40 μg之间。

3.4 优化后的精密度

称取约0.04 mg乙酰苯胺，连续测定6次，结果列于表2，STD为0.184‰，表明优化后仪器的精密度良好。乙酰苯胺δ15N的真实值为1.18‰，6个平行样的测试值和真实值的标准偏差均小于0.2‰，符合测试标准。

3.5 沉积物样品中氮同位素δ15N值测试结果

分别称取5、10、15 mg低含氮量的沉积物样品(氮含量约0.09%)，用优化后的EA-IRMS检测，每种质量的样品平行测定4次，结果列于表3。A1、A2、A3和A4样品的氮同位素δ15N值的STD小于0.2‰；同时，3组不同质量沉积物样品中氮同位素δ15N平均值STD为0.15‰(n=3)，小于0.2‰。表明EA-IRMS优化后，测试含氮质量大于4 μg的固体样品时，其样品氮含量和氮同位素测试结果的平行性和准确度都能满足仪器测试要求。

表2 乙酰苯胺精密度测试结果Table 2 Precision test results of acetanilide

表3 沉积物的测定结果Table 3 Test results of sediment

4 结论

传统EA-IRMS检测固体样品中的氮同位素组成时，要求其氮含量大于20 μg才能获得相对准确的数据。对于低含氮量固体样品，包样质量较大，在燃烧管中不能被瞬间充分氧化，使氮同位素测试结果存在较大误差。仪器优化后，氮同位素的检出限降低5倍(4 μg)以上，常规的低含氮量固体样品包样质量可以控制在5～20 mg之间，很大程度上避免了因为燃烧不充分而导致的同位素分馏现象。本研究对EA-IRMS的优化改造能满足检测低含氮量固体样品的技术需求，同时对设计其他低含氮量样品的检测仪器具有借鉴意义。