超声雾化萃取大气压光电离质谱法快速分析烟草化学成分

赵 婉，王 健，戚可可，胡永华，吴刘天，刘成园，潘 洋

(1.中国科学技术大学国家同步辐射实验室，安徽 合肥 230029； 2.安徽中烟工业有限责任公司技术中心，安徽 合肥 230088)

烟草作为一种重要的农业产品，化学成分丰富，除含有纤维素、半纤维素、果胶和木质素等生物聚合物外，还有许多生物碱、有机酸类、酚类、酮类、酯类、醚类等非聚合物成分和无机化合物，这些化学成分不仅决定了烟草的外观特征和内在品质，还与烟草制品的口感、刺激性、香气等吸食品质直接相关[1-6]。因此，对烟草化学成分的分析是一项十分重要的基础性研究工作，也是构筑烟草制品核心技术的关键之一。随着烟草工业的发展，产品研发与维护、质量评价以及工艺研究等均需要以烟草成分的快速、准确分析为基础。

气相色谱(GC)[7-8]和液相色谱(LC)[9-10]等色谱分析方法是烟草化学成分分析的重要技术手段，在烟草行业发挥着重要作用，但其分析步骤繁琐，包括待测组分的提取、分离、富集、衍生化等复杂的前处理过程，而且色谱分析耗时[7,11-14]。因此，色谱法难以满足烟草行业快速批量化测定烟草化学成分的现实需求。为了克服色谱法的缺点，近红外光谱作为一种快速、无损的分析方法，已经成功地应用于烟草化学成分的快速分析和研究中[15-17]。然而，使用近红外光谱法分析待测样品前，需要使用大量有代表性的、化学成分含量已知的样品建立模型。由于仪器状态的改变或标准样品的变化，模型需不断更新，而且不同仪器的模型也不相同，这限制了该方法的使用。

在分析化学领域，质谱作为一种普适的、快速的分析手段，具有高灵敏度、高特异性的优点。但是，传统的质谱分析技术常需要与色谱技术相结合才能获得较好的分析测试结果，如气相色谱-质谱(GC-MS)技术[18-21]和液相色谱-质谱(LC-MS)技术[22-26]。为得到较高的检测灵敏度，色谱-质谱联用法依旧无法完全避免提取、分离、富集、衍生化等各种预处理操作，存在操作繁复、耗时等不足。而且GC-MS常使用能量70 eV的电子轰击电离源(EI)，会产生大量的碎片离子，在分析烟草样品等复杂体系时，质谱图较复杂，解析难度较大。常用于LC-MS的电喷雾电离源(ESI)仅对极性物质具有较高的电离效率，且受基质效应的影响较大。大气压光电离离子源(APPI)是一种由光诱导待测物分子电离的常压软电离技术，与传统的ESI离子源相比，APPI对待测物没有极性歧视，尤其适合ESI难以直接电离的各类弱极性和非极性物质的检测，且受基质效应的影响较低[27-30]。目前，APPI作为GC-MS 或LC-MS的电离源，已经成功应用于食品、环境、医药和生物等领域的分析研究[31-35]。此外，有一些研究围绕APPI质谱分析技术本身，在不进行色谱分离的情况下直接对待测物进行分析，集样品制备与分析于一体，适合各种复杂体系的快速分析[36-38]。超声雾化萃取大气压光电离质谱(EAPPI-MS)是基于APPI发展起来的一种新型快速质谱分析技术[37]，该方法利用压电陶瓷片产生的高频振荡，可使复杂基质中的化学成分被快速萃取至溶剂中，含有待分析物的溶剂随即被超声波雾化后进入大气环境，被真空紫外放电灯发出的光(氪灯，光子能量10.6 eV)电离，产生的离子随后被质谱仪检测和记录。EAPPI-MS在工作过程中无需对待测物进行分离、富集、衍生化等预处理操作，具有快速、操作简单和灵敏度高等特点。本课题组在前期研究中已成功利用EAPPI-MS技术实现了对天然产物、药物、重油、土壤中化学成分的快速分析，并开展了土壤多环芳烃类的定量方法[37-38]。

本工作拟利用EAPPI-MS分析平台对1R5F、3R4F、都宝、七星和王冠5种卷烟烟丝中的醇、酮、酯、醛、酚、酸、生物碱、氨基酸和萜类等化合物进行快速全面分析，希望建立一种烟草化学成分快速、准确、高灵敏度的分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪、Acclea 1250高效液相色谱仪：美国Thermo Fisher公司产品；402AI超声雾化器：鱼跃医疗设备供应有限公司产品；PKS106真空紫外放电灯：德国Heraeus公司产品；超纯水仪：美国Millipore公司产品；电子天平(千分之一)：瑞士Mettler Toledo公司产品；KQ-500E型超声清洗机：昆山超声仪器有限公司产品；离心机：上海迈皋科学仪器有限公司产品；注射器(500 μL)：瑞士Hamilton公司产品。

1.2 主要材料与试剂

实验用卷烟材料分别为1R5F、3R4F标准卷烟和七星、都宝、王冠成品卷烟，均由安徽中烟工业有限责任公司提供。实验前，将卷烟纸和烟丝分离，获得相应的烟丝，每次测试均称取10 mg烟丝样品。

甲醇、二氯甲烷、甲苯和甲酸等试剂(HPLC级)：购自美国J.T.Baker公司；超纯水：由美国Milli-Q超纯水系统制备；液氮(99.8%)：购自南京特种气体厂。所有试剂均直接使用，未做进一步纯化处理。

1.3 实验条件

1.3.1实验装置 实验装置结构示意图示于图1。该装置主要由超声雾化萃取系统、真空紫外灯和高分辨质谱仪组成[37]。超声雾化萃取系统包括超声雾化器、超声雾化池和掺杂剂鼓泡器。其中，超声雾化器内部装有超声换能器和耦合水(超纯水)，超声换能器工作频率为1.7 MHz ±10%；超声雾化池(内径16 mm，高55 mm)上部的侧壁上分别设置有载气1流入管(内径2 mm，长15 mm，深25 mm)和样品传输管(内径6 mm，外径9 mm，长60 mm)，底部用由“O”形圈固定的聚乙烯膜包裹，并置于耦合水中；掺杂剂鼓泡器的侧壁上设置有载气2流入管(内径2 mm，长15 mm，深35 mm)，顶部设置有与样品传输管相汇合的载气2流出管(内径6 mm，外径9 mm，长180 mm)，且两管汇合后的传输管出口逐渐缩小至内径为1.5 mm。真空紫外灯垂直置于汇合传输管与质谱仪接口之间。当打开超声雾化器的工作电源后，超声雾化池中的样品溶液将吸收由超声换能器传递过来的能量，然后雾化成气溶胶，并在载气1的帮助下流经样品传输管，并与由载气2携带的气相掺杂剂在传输管汇合处混合，然后进入光电离区域，从而实现掺杂剂辅助的大气压光电离，电离产生的离子随后被质谱检测。由于在大气压下，溶剂与空气都会吸收大量的紫外光，直接光电离的效率很低；而气相掺杂剂(本研究采用甲苯作为掺杂剂)吸收紫外光子能力强，光电离截面大，很容易被电离，并通过电子转移或质子交换反应使样品分子电离，因此使用掺杂剂可以大大提高被分析物的光电离效率。实验过程中，载气1和载气2的流速分别设定为80 mL/min和60 mL/min；样品传输管和载气2流出管使用加热丝加热，且温度均设定为320 ℃，以保证雾化小液滴能在传输管中被充分气化。

注：1.超声雾化器；2.耦合水；3.超声换能器；4.“O”形圈； 5.聚乙烯薄膜；6.超声雾化池；7.萃取溶剂； 8.掺杂剂鼓泡器；9.样品传输管；10.真空紫外灯图1 超声雾化萃取大气压光电离质谱装置示意图Fig.1 Schematic setup of EAPPI-MS

1.3.2EAPPI-MS分析 先将4 mL不同极性萃取溶剂(甲醇∶水=3∶1，甲醇，二氯甲烷∶甲醇=1∶4或二氯甲烷∶甲醇=2∶3，V/V)加入超声雾化池中，然后投入10 mg烟丝，开启超声雾化器，被雾化的待分析物经真空紫外灯光电离后，进行质谱检测。自超声雾化器开启，连续采集信号60 s，获得平均质谱图。质谱的毛细管温度为275 ℃，毛细管电压为35 V，采集范围为m/z50～350，采集速率为1 scan/s，分辨率为60 000 FWHM。质谱的定性分析采用准确相对分子质量(相对偏差的绝对值<8×10-6)、同位素丰度并结合相关文献。为了通过质谱图区分不同类型的烟草制品，将测试得到的质谱数据导入MATLAB软件，进行主成分分析(PCA)。每次测试样品前后均对溶剂进行测试作为背景信号，在样品数据分析前，均先扣除背景信号。

1.3.3LC-ESI-MS分析 为了比较EAPPI-MS与传统LC-ESI-MS的分析能力，取10 mg烟草样品，加入4 mL萃取溶剂，使用超声清洗机超声1 min后，以9 000 r/min离心5 min，取100 μL上层清液，由高效液相色谱泵进样，然后进行LC-ESI-MS分析。

色谱柱：Accucore Vanquish C18柱(100 mm×2.1 mm×1.5 μm)；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液(体积比)；流速为200 μL/min；柱温为30 ℃；进样量为5 μL；等度洗脱3 min，流动相配比为 90%A-10%B；ESI离子源正离子模式；喷雾电压为3 500 V；气化温度为150 ℃。

2 结果与讨论

2.1 烟草化学成分定性分析结果

首先利用EAPPI-MS方法获得5种卷烟烟丝的质谱图，并对烟草中主要成分的质谱峰进行定性分析。七星卷烟烟丝经超声雾化萃取60 s后，得到的光电离质谱图示于图2(背景信号已扣除)。由于APPI是软电离源，碎片离子很少，因此图2中质谱信号主要是待测物的分子离子峰 M+或准分子离子峰[M+H]+ [39-40]。

通过查找“中国烟草科学技术数据库”，将EAPPI-MS测试获得的高分辨质谱图中的质荷比(m/z)与特定物质的理论m/z进行比对，计算得出相对质量偏差：

相对质量偏差(×10-6)=

[(测试m/z-理论m/z)/理论m/z]×106

(1)

将相对质量偏差的绝对值低于8 ppm的结果列于表1，使用相对质量偏差代表质量精确度。通过分析和比对，推测和鉴别出醇、酮、酯、醛、酚、酸、生物碱、氨基酸和萜类等46种化合物，基本涵盖了大部分常见的烟草化学成分类别，表明EAPPI-MS对烟草化学成分的定性分析结果具有一定的代表性。除此之外，通过EAPPI-MS获得了其他4种卷烟的质谱图。从质谱图上看，各卷烟制品的质谱峰种类相似，其差异主要表现在化学成分的信号强度上。

图2 七星卷烟烟丝的EAPPI-MS质谱图Fig.2 Mass spectra of Seven Stars using EAPPI-MS

表1 EAPPI-MS检测5种卷烟烟丝得到的质谱峰定性结果Table 1 Qualitative results of 5 kinds of tobaccos using EAPPI-MS

续表1

注：a.m/z 50～162；b.m/z 165～350图3 EAPPI-MS和LC-ESI-MS方法测试七星卷烟的质谱图Fig.3 Mass spectra of Seven Stars using EAPPI-MS and LC-ESI-MS

2.2 EAPPI-MS和LC-ESI-MS方法的比较

目前，LC-MS在烟草化学成分分析中得到广泛应用，商用LC-MS的电离方式主要是ESI[41]。该方法需要先对复杂基质样品进行预处理，再将相对纯净的样品溶液通过注射器导入色谱中，经分离富集后送至质谱的电离区域，样品分子经离子化后被检测分析，操作繁复且费时。EAPPI-MS成功地将样品的提取和离子化结合在一起，使待测物的解吸和电离同步进行，无需样品预处理，大大减少了测试时间，提高了分析效率。为体现EAPPI-MS分析烟草样品的优势，以二氯甲烷-甲醇溶液(2∶3，V/V)为萃取溶剂，使用EAPPI-MS对七星卷烟进行分析测试，并与传统LC-ESI-MS方法对比，得到的质谱图示于图3。

通过对比质谱图可以发现，在m/z50～162范围内，EAPPI-MS和LC-ESI-MS均可检测到脯氨酸(m/z116.07)、2-吡咯甲酸甲酯(m/z126.05)、降烟碱(m/z149.11)和去氢新烟碱(m/z161.11)；EAPPI-MS可以高灵敏度地检测到二烯烟碱(m/z159.09)，而LC-ESI-MS未检测到。在m/z165～350范围内，EAPPI-MS可以高灵敏度地检测到(2′S)尼古丁氧化物(m/z179.12)，而LC-ESI-MS几乎没有检测到。表明EAPPI-MS可以检测到更丰富的物质信号。除此之外，受预处理和色谱分离的影响，LC-ESI-MS需要消耗较长时间才能完成对单个样品的分析测试，然而EAPPI-MS仅需要1 min，节省了分析测试时间。EAPPI-MS具有较强的抗基质效应干扰能力、无电离极性歧视等特点，以及直接、快速、高灵敏度的优势，将会成为烟草样品快速分析的有力工具。

2.3 烟草萃取溶剂的选择

由于烟草样品基质较复杂且成分丰富，在样品提取时，不同的萃取液提取效果不同，因此需要选择合适的萃取溶剂，以获得更丰富的质谱信号和更高的质谱响应。选取甲醇-水(3∶1，V/V)、甲醇、二氯甲烷-甲醇(1∶4，V/V)和二氯甲烷-甲醇(2∶3，V/V)4种不同极性的溶剂作为萃取溶剂，分别萃取1R5F、3R4F、七星、都宝和王冠5种卷烟烟丝，在EAPPI-MS正离子模式下研究萃取溶剂对烟草化学成分提取和电离效果的影响，分析比较了烟丝中的烟碱、麦思明、愈创木酚、亚麻酸、脯氨酸、3，5-二甲基异唑、吡啶-2-甲醛和3-甲基吲哚在5种卷烟烟丝质谱强度的平均值，结果示于图4。除了二氯甲烷-甲醇(1∶4，V/V)未提取到愈创木酚外，4种萃取溶剂无论是对烟草中含量较高的成分，如烟碱和3-甲基吲哚，还是低含量组分均能有效提取。相比之下，二氯甲烷-甲醇(2∶3，V/V)对烟草中的生物碱(烟碱和麦斯明)、酚类(愈创木酚)、有机酸(亚麻酸和脯氨酸)、香味成分(3，5-二甲基异唑、吡啶-2-甲醛和3，5-二甲基异唑)均具有更高的萃取效果。表明二氯甲烷-甲醇(2∶3，V/V)萃取剂更适合于EAPPI-MS方法对烟草化学成分的分析，且适用于多种烟草成分的同时提取和检测。

2.4 不同烟草化学成分分析比较

目前市场上流通的卷烟种类繁多，不同品牌的卷烟由于配方和生产工艺的差别在品质方面存在差异，但因烟草市场体量巨大，对烟草成分快速、全面分析依然充满挑战。传统的LC-MS或GC-MS操作繁复费时[1,42-44]，而EAPPI-MS方法可以快速准确分析待测样品，无需样品预处理，1 min即可完成一次样品测试，适用于大量烟草样品的快速分析。

图4 比较4种不同的萃取溶剂提取烟草化学成分的 EAPPI-MS平均信号强度Fig.4 Average EAPPI-MS ion intensities of chemical components in 5 kinds of tobaccos extracted by 4 kinds of extraction solvents

烟草化学成分复杂，卷烟品质不仅与烟碱、糖、钾等常规成分有关，还与一些能给人带来良好感官体验的香味成分以及部分有害成分相关[45]。随着人们健康意识的增强，低焦油、高香味成了烟草工业对于卷烟品质的指导标准[46]。为了分析比较不同卷烟化学成分的差异，使用EAPPI-MS方法对烟草中的化学成分做整体评估，利用质谱信号的强弱比较不同种类卷烟样品中化学成分的含量。本实验使用EAPPI-MS方法，分别对1R5F、3R4F、都宝、七星和王冠5种卷烟烟丝中的主要生物碱、有机酸和酚类的相对含量进行快速检测，结果示于图5。

烟草中高含量的生物碱是吸烟者吸食烟草的主要原因。在抽吸卷烟时，生物碱含量的高低直接影响卷烟的吸味，是评价烟叶内在品质和可用性的重要指标。生物碱的种类和含量与烟草品种有关，其中烟碱是烟草中含量最高的生物碱[47]。在这5种卷烟中，1R5F和3R4F属于标准烟，都宝属于由烤烟和白肋烟组成的混合型卷烟，七星属于烤烟，王冠属于雪茄烟。烤烟是目前种植面积最大的烟草种类，国产烟主要以烤烟为主。白肋烟原产于美国，属于一种深褐色晾烟，但与一般晾烟不同的是其叶脉和主茎发白，烟碱含量较高。雪茄经烟草发酵制成，烟碱和焦油大幅下降。如图5a所示，都宝卷烟中的烟碱、去氢新烟碱和N-甲基去氢新烟碱的相对含量较高，这与白肋烟的特性相关。在王冠雪茄中，麦斯明、降烟碱和2-3’-联吡啶的含量相对较高。降烟碱是烟碱脱去甲基形成的，烟碱转化导致烟碱含量降低，使烟叶香气减少，有害成分亚硝胺增加[48-50]。降烟碱具有较大的不稳定性，在烟叶调制和陈化过程中易生成麦斯明和吡啶化合物，使烟气具有碱味、鼠臭等异味，烟草品质下降[51]。

图5 5种卷烟烟丝中生物碱(a)、有机酸(b)和酚类化合物(c)的相对含量Fig.5 Relative contents of alkaloids (a), organic acids (b) andphenolics (c) in 5 kinds of tobaccos

有机酸能够增加烟气的酸性，提高烟气浓度并使其醇和、甜润、舒适[52]。对烟草中非挥发性有机酸、高级脂肪酸的测定已成为烟草行业质量控制的重要内容。氨基酸是烟叶香气前体物，同时也是美拉德反应前体物，对烟草香味有重要贡献，氨基酸含量增高有利于增加香气和得到适宜的劲头，但含量过高会使香气品质变差，刺激性增强，杂气加重。脯氨酸是非极性氨基酸，是烤烟中含量最高的游离氨基酸，约占总游离氨基酸的20%以上；在白肋烟中，脯氨酸的含量并不显著，仅占总游离氨基酸的4%左右[52]。如图5b所示，七星卷烟中的L-脯氨酸含量较高，都宝卷烟中含量最低，这一结果与上述规律基本一致。谷氨酸属于酸性氨基酸，在几乎所有的氨基酸合成过程中做氨基供体，在这3种商品烟中，都宝卷烟中的谷氨酸含量最高。苯丙氨酸属于非极性脂肪族氨基酸，是一些酚类化合物(如绿原酸、阿魏酸等)合成过程中的重要中间产物，这些酚类化合物对烟叶品质、色泽和烟气等有重要影响[52]。都宝和七星卷烟中的苯丙氨酸含量相差不大，且均高于王冠雪茄，其中七星卷烟中苯丙氨酸的含量相对较高。烟草中的高级脂肪酸也是评价烟草品质的有效指标，但是亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸会增加烟草的刺激性[53]。王冠雪茄中亚油酸、亚麻酸的相对含量较高。

酚类化合物对烟叶色泽、香味、烟气生理强度和烟草品质具有重要影响，其含量与烟草等级正相关[54-56]。如图5c所示，在这3种商品化卷烟中，都宝卷烟的酚类含量普遍较高，王冠雪茄由于是经过烟叶发酵后制成的，部分香味物质在制作过程中有所损失，愈创木酚和8-羟基喹啉均未检测到，而二甲酚的含量较高。甲酚和二甲酚多来自于木质素、纤维素的分解产物[57]。在抽吸过程中，愈创木酚与口腔唾液蛋白相结合，表现出甜味、温和及增浓效果[58]。总体而言，不同种类的卷烟因成分含量不同而各具特色，都宝和七星卷烟比王冠雪茄香味成分更丰富。

图6 使用EAPPI-MS方法测试5种卷烟烟丝的 主成分分析结果Fig.6 Principal component analysis results of 5 kinds of tobaccos using EAPPI-MS

2.5 主成分分析

为了快速筛查不同品质类型的烟草制品，选取优化后的二氯甲烷-甲醇(2∶3，V/V)萃取溶剂，对1R5F、3R4F、都宝、七星和王冠5种不同类型的多批次卷烟进行萃取，通过EAPPI-MS检测分析，分别提取5种卷烟在m/z50～350范围内的质谱信号进行主成分分析(PCA)，结果示于图6。这5种卷烟样品通过2个主成分因子(PC-1和PC-2)明显区分，同一种烟草制品数据在图中自成一簇(已分别用圆圈圈出)，具有相似的性质，而不同的烟草制品的数据簇之间相隔较远，表明不同的烟草制品之间性质相差较大。PC-1和PC-2的得分总和为80%，表明主成分提取较完全，可以在很大程度上替代原有的样品信息，说明EAPPI-MS法可以有效地对不同种类烟草样品进行快速区分。

3 结论

本文报道了一种烟草化学成分的快速分析方法——萃取大气压光电离质谱。该方法可以对烟草的化学组分快速、准确定性，全面评估烟草中的主要成分及相对含量，快速区分不同类型的烟草制品。由于该方法将萃取和电离过程结合在一起，样品提取和分析同步进行，无需复杂的样品预处理操作，操作简便，分析速度快，1 min即可完成1次测试，满足高通量的检测要求。本方法对待测样品没有极性歧视，尤其适合于弱极性物质的检测。通过对比不同极性溶液萃取结果，优化了适用于烟草体系的二氯甲烷-甲醇(2∶3，V/V)萃取溶剂，全面评估烟草中的主要生物碱、有机酸和酚类化合物，并结合PCA分析，快速区分了1R5F、3R4F、都宝、七星和王冠5种卷烟。本方法可以快速批量化测定烟草化学成分含量，在烟草品质评价、配方设计以及工艺研究等方面有着广阔的应用前景。