吸附剂针对性净化-气相色谱-三重四极杆串联质谱测定油茶果中55种持久性有机污染物

沈丹玉，袁新跃，王 蕤，王若辉，郑悦雯，吴书天， 刘毅华，莫润宏，钟冬莲，汤富彬

(1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400； 2.杭州市富阳区食品安全检验检测中心，浙江 杭州 311400)

持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)是一类对人类健康和环境具有严重危害的天然或者人工合成的有机污染物质。POPs具有“三致性”，即致癌、致畸、致突变；同时还具有半挥发性，在环境中极难降解，能够在大气环境中长距离迁移而在全球范围内扩散，使得POPs污染不仅是区域性问题，也是一个全球性的环境问题[1-2]。国际社会为了淘汰和削减POPs的生成和排放，保护环境和人类免受其危害，2001年5月22日联合国通过了《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》[3]。常见的POPs有多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)和有机氯农药(organochlorine pesticides, OCPs)等。其中，PCBs是人工合成的有机物，在工业上用作热载体、绝缘油和润滑油，全世界生产和应用的PCBs远超过100万吨，其中已有1/4至1/3进入人类环境，造成危害[4]；PAHs主要来自人类工业生产和生活等方面的人为来源，包括原油类在使用或运输过程中的泄露、焦化过程中的煤炭燃烧、石油等化石燃料的不完全燃烧、农作物秸秆焚烧、薪柴燃烧等[5]；OCPs因杀虫效果显著曾被广泛使用，尽管现在已停止生产和使用，但由于其持久性和难降解性，可以在环境介质(土壤、沉积物、水体、植被等生物体)中存留数十年或者更长时间，并且通过生物富集[6]。POPs具有疏水性、亲脂性和富集性，易于在环境中长期残留，并可通过食物链累积和放大[7-8]。

油茶是世界四大木本油料之一，是我国特有的油料树种。研究油茶果不同部位有害污染物的含量是对油茶籽和油茶籽油进行质量安全评价的前提。现有的标准GB5009.190—2014《食品安全国家标准 食品中指示性多氯联苯含量的测定》和GB5009.265—2016《食品安全国家标准 食品中多环芳烃的测定》均指明了适用于动物性食品和油脂类试样中指示性PCBs测定和食品中PAHs测定的方法，不涉及油料作物。目前，国内外POPs研究的对象主要集中在大气、水体、土壤和沉积物等环境类样品，以及肉类、蛋类、水产品等动物性食品[9-12]，植物性样品的POPs检测报道相对较少[13-15]，而油茶籽POPs检测方法的报道只有苯并(a)芘[16]和18种PCBs[17]。由于油茶样品富含油脂、各种植物色素、皂素和蛋白质，其基质复杂，故将POPs从油茶果样品中分离富集出来是决定分析结果可靠性的重要前提。

近年来，气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)技术已逐步应用于痕量有机物的分析[18-19]。本研究拟比较不同吸附剂对油茶果不同部位的针对性净化效果，采用GC-MS/MS法测定油茶籽仁、油茶外种皮和油茶壳中55种POPs，希望为油茶果及其他油料作物的POPs检测提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器及材料

7000B QQQ气相色谱-三重四极杆串联质谱仪：美国Agilent公司产品；T18高速均质机：德国IKA公司产品；Biofuge Stratos冷冻离心机：美国Thermo Fisher公司产品；HCG-24A氮吹浓缩仪：天津恒奥科技公司产品；DMT2500多管漩涡混合仪：上海圣科仪器设备有限公司产品；CPA225D分析天平：德国Sartorius公司产品。

油茶果样品：2018年11月采自湖南、江西、浙江3个油茶主产省份。

1.2 实验方法

1.2.1油茶籽仁中POPs的提取与净化 称取10 g磨碎的油茶籽仁样品于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈均质1 min，再加入2 g NaCl，以2 500 r/min多管漩涡混合2 min，5 000 r/min离心5 min。分取5 mL上清液于已加入300 mg无水MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和3～7 mg NANO Carb的10 mL离心管中，以2 500 r/min多管漩涡混合2 min，10 000 r/min离心5 min。转移2.5 mL净化上清液于40 ℃下氮气吹干，用1 mL正己烷定容，加入20 μL环氧七氯内标溶液，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.2.2油茶外种皮和油茶壳中POPs的提取与净化 称取10 g磨碎的油茶外种皮或油茶壳样品于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈均质1 min，再加入2 g NaCl，以2 500 r/min多管漩涡混合2 min，5 000 r/min 离心5 min。分取5 mL上清液于已加300 mg无水MgSO4、100 mg PSA(或100 mg C18，100 mg Florisil，100 mg Si，100 mg SCX，20 mg NANO Carb，50 mg Pesticarb)的10 mL离心管中，以2 500 r/min多管漩涡混合2 min，10 000 r/min 离心5 min。转移2.5 mL净化上清液于40 ℃氮气吹干，用1 mL正己烷定容，加20 μL环氧七氯内标溶液，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.2.3标准工作溶液的配制 准确吸取0.50 mL多环芳烃标准溶液、1.00 mL多氯联苯标准溶液、10 mL有机氯标准溶液于容量瓶中，正己烷定容，配制成2～25 mg/L标准储备液(其中，α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、六氯苯、毒杀芬和灭蚁灵为2 mg/L，α-硫丹和β-硫丹为20 mg/L，异狄氏剂为25 mg/L，其他45种POPs为10 mg/L)，4 ℃保存。再分别吸取0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL标准储备液于10 mL容量瓶，正己烷定容，配制成梯度混合标准工作液，4 ℃保存，备用。

准确称取30 mg环氧七氯内标物于10 mL容量瓶中，正己烷定容，配制成 3 000 mg/L内标溶液，4 ℃保存，备用。

每个梯度混合标准工作液1 mL，添加20 μL内标溶液，摇匀上机。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 HP-5MS 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：初始温度70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min升温至150 ℃，再以3 ℃/min升温至200 ℃，最后以8 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min；进样口温度280 ℃；载气为高纯氦气(99.999%)，流速2.4 mL/min；不分流进样，进样量1.0 μL。

裂缝贯穿7#桥台，其下方紧邻6#桥墩，无论发生何种破坏，将直接对7#桥台的基础产生破坏，若发生侧向滑移(塌)，则直接对6#桥墩造成破坏，都会直接导致大桥损毁，高速断道，直径经济损失巨大，社会影响严重。

1.3.2质谱条件 电子轰击(EI)离子源，电离能量 70 eV，离子源温度 230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度 280 ℃，溶剂延迟 5 min，灯丝电流100 μA。分别对55种标准品进行全扫描，以化合物的最大m/z作为母离子；接着调用product方法，优化碰撞电压，以m/z最大和次大的子离子作为定性离子，m/z最大的子离子为定量离子；最后根据各化合物的出峰顺序、母离子和子离子的m/z、碰撞电压等参数建立多反应监测(MRM)模式，具体参数列于表1。定量方法为峰面积内标法。55种持久性有机污染物的气相色谱-串联质谱图示于图1。

表1 55种持久性有机污染物的保留时间、定量及定性离子对、碰撞电压Table 1 Retention time, qualitative ions, quantitative ions and collision energy of 55 POPs

续表1

注：化合物1～55同表1图1 55种持久性有机污染物的气相色谱-串联质谱图Fig.1 Mass spectrum of 55 POPs by GC-MS/MS

2 结果与分析

2.1 针对性净化效果比较

图2 吸附剂净化油茶籽仁、 外种皮和油茶壳的效果对比Fig.2 Comparison for the clean-up effects of camellia seed kernel, episperm and shell extracts by adsorbents targeted purification

采用不同吸附剂对油茶果各部位提取液进行净化，外观效果示于图2。油茶籽仁提取液未经净化(k0)时呈黄色；前期研究确定600 mg无水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA和5 mg NANO Carb联合净化油茶籽提取液能够得到满意的效果，并且18种多氯联苯的回收率可以满足要求。在此基础上，本研究采用300 mg无水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA(k1)净化，提取液变为浅黄色；再分别添加3 mg(k2)、4 mg(k3)、5 mg(k4)、6 mg(k5)、7 mg(k6) NANO Carb联合净化，提取液均为无色透明。

油茶外种皮提取液未经净化(e0)时呈深黄色；经100 mg C18(e2)、100 mg SCX(e5)和100 mg Si(e4)净化，提取液均变浅；经100 mg Florisil(e3)和100 mg PSA(e1)净化，提取液为浅黄绿色；经20 mg NANO Carb(e6)净化，提取液颜色明显变浅；经50 mg Pesticarb(e7)净化，提取液接近无色。

油茶壳提取液未经净化(s0)时呈红褐色；经100 mg C18(s2)和100 mg Si(s4)净化，提取液均变成深黄色；经100 mg Florisil(s3)、20 mg NANO Carb(s6)和50 mg Pesticarb(s7)净化后，提取液均变浅；经100 mg SCX(s5)净化，提取液接近无色；经100 mg PSA(s1)净化，提取液变为无色透明。

油茶籽仁含有大量的脂肪，样品共提物中含有色素、蛋白质等大分子干扰物质，从外观净化结果看，向300 mg无水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA中添加3～7 mg NANO Carb对油茶籽仁提取液的净化效果较好。油茶果皮含有大量色素、鞣质和皂苷，比较几种吸附剂对油茶果皮提取液的净化外观，50 mg Pesticarb净化效果最好。油茶壳含有茶皂素、多糖、蛋白质等，100 mg PSA对油茶壳提取液的净化效果较好。

2.2 线性关系、检出限与定量限

对系列混合标准工作液进行测定，以目标化合物与内标的峰面积相对值和对应的质量浓度进行线性回归，得到55种POPs标准曲线的线性方程、相关系数、检出限和定量限，结果列于表2。55种POPs在各自的范围内具有良好的线性关系，除Phe、p,p′-DDD、p,p′-DDT和Bbf的相关系数为0.992 1～0.994 5外，其他51种POPs的相关系数为0.995 0～0.999 9，其中有23种POPs的相关系数大于0.999。16种多环芳烃检出限为2.17～65.5 μg/kg；低、中环多环芳烃除NaP、BaA、Chr、An和Flu分别为17.34、11.85、9.11、6.31和6.72 μg/kg外，其余5种检出限均在2.17～2.57 μg/kg之间；6种高环多环芳烃检出限为30.61～65.50 μg/kg。18种多氯联苯检出限为0.69～4.75 μg/kg，定量限为2.29～15.82 μg/kg；其中PCB105、PCB126和PCB189定量限分别为13.18、14.48、15.82 μg/kg，其他15种多氯联苯定量限均低于8.13 μg/kg。21种多氯联苯检出限为0.18～22.35 μg/kg，定量限为0.58～74.52 μg/kg；其中狄氏剂、β-硫丹、α-硫丹、异狄氏剂和顺-氯丹的定量限较高，分别为74.52、52.06、37.29、20.64、12.29 μg/kg；毒杀芬、灭蚁灵、艾氏剂和p,p′-DDE的定量限较低，分别为0.58、0.84、1.31、1.41 μg/kg；其余12种多氯联苯定量限为2.82～7.56 μg/kg。

2.3 加标回收率

分别对油茶籽仁、外种皮和油茶壳进行55种POPs加标回收实验，选择5、25、250 μg/kg 3个添加水平，做3次平行实验，计算平均回收率，结果示于图3。从图3a可知，油茶籽仁提取液采用300 mg无水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA(k1)净化，55种POPs的回收率为75.3%～148.3%，其中有33种化合物的回收率为80%～120%；分别添加3 mg(k2)、4 mg(k3)、5 mg(k4)、6 mg(k5)、7 mg(k6) NANO Carb联合净化，回收率在80%～120%范围内的化合物有37、43、46、49、40种。因此，确定采用300 mg无水MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA和6 mg NANO Carb对油茶籽仁提取液进行联合净化，除BghiP回收率为69.1%，Nap、BaA、Bbf和Inp回收率为70.4%～75.6%，DaA回收率为121.0%外，其他49种化合物的回收率均在80%～120%之间。

表2 55种持久性有机污染物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LOD and LOQ of 55 POPs

续表2

图3 油茶籽仁(a)、外种皮(b)和油茶壳(c)中55种持久性有机污染物的添加回收率(n=3)Fig.3 Spiked recoveries of 55 POPs in camellia seed kernel (a), episperm (b) and shell (c)(n=3)

从图3b可知，油茶外种皮提取液经100 mg PSA(e1)、100 mg C18(e2)、100 mg Florisil(e3)、100 mg Si(e4)、100 mg SCX(e5)、20 mg NANO Carb(e6)和50 mg Pesticarb(e7)净化，回收率在80%～120%范围内的化合物分别有42、35、26、29、25、22、25种，100 mg PSA回收率较好，100 mg C18次之，20 mg NANO Carb和50 mg Pesticarb净化条件下分别有16、14种化合物的回收率低于70%，表明20 mg NANO Carb或50 mg Pesticarb对部分化合物存在吸附作用。而按照图2的色素净化外观呈现，50 mg Pesticarb净化效果最佳，其次为20 mg NANO Carb，再次为100 mg PSA。因此，兼顾回收率和色素净化，选择300 mg无水MgSO4、100 mg PSA、20 mg Pesticarb对油茶外种皮提取液进行净化，55种POPs的回收率在75.9%～138.2%之间，其中有44种化合物的回收率在80%～120%范围内。

从图3c可知，油茶壳提取液经100 mg PSA(s1)、100 mg C18(s2)、100 mg Florisil(s3)、100 mg Si(s4)、100 mg SCX(s5)、20 mg NANO Carb(s6)和50 mg Pesticarb(s7)净化，回收率在80%～120%范围内的化合物分别有46、25、21、25、36、23、34种，100 mg PSA回收率最好，100 mg SCX(s5)和50 mg Pesticarb回收率次之，刚好与之前的净化外观效果一致。因此，确定采用300 mg无水MgSO4和100 mg PSA对油茶壳提取液进行净化，回收率为78.2%～135.5 %。

2.4 实际样品的测定

将本方法应用于来自湖南、江西和浙江3个省份54份油茶样品分离后的油茶籽仁、油茶外种皮和油茶壳中55种POPs的检测，代表性油茶籽仁样品的气相色谱-串联质谱图示于图4。 三省份不同产区的油茶果样品中POPs检测结果经SPSS19.0统计软件进行均值比较，结果示于图5。可见，油茶籽仁检出较高的POPs为NaP、狄氏剂、Fl、毒杀芬、Phe、α-BHC和Ace，检出含量分别为(566.26±105.94)、(204.88±43.04)、(14.03±0.52)、(13.75±0.69)、(13.75±0.52)、(13.05±3.34)、(4.36±0.34) μg/kg。油茶外种皮检出率较高的POPs为NaP、Fl、Phe、毒杀芬、α-BHC和Ace，检出含量分别为(1 109.43±118.17)、(10.93±0.41)、(9.97±0.42)、(9.63±0.61)、(7.30±2.00)、(3.62±0.26) μg/kg。油茶壳检出率较高的POPs为NaP、毒杀芬、Fl和Phe，检出含量分别为(703.57±123.73)、(7.03±0.66)、(6.03±0.38)、(5.13±0.37) μg/kg。

图4 油茶籽仁代表性样品55种持久性有机污染物的气相色谱-串联质谱图Fig.4 Mass spectrum of 55 POPs in representative camellia seed kernel by GC-MS/MS

图5 油茶果结构和55种持久性有机污染物的检出分布Fig.5 Structure of camellia oleifera fruit and the detection and distribution of 55 persistent organic pollutants

其中，Nap含量为油茶外种皮(1 109.43 μg/kg)>油茶壳(703.57 μg/kg)>油茶籽仁(566.26 μg/kg)，是具有2个苯环的低环PAHs，由于蒸气压较高，主要分布在气相中，因此推测油茶Nap污染主要来自环境大气；Ace、Fl、Phe含有3个苯环，Flu具有4个苯环，3～4个苯环的PAHs在气相和固相中均有分布，推测污染来源为环境中的大气和土壤，3～4环的多环芳烃在油茶籽仁中高于油茶壳和外种皮，进一步验证了多环芳烃具有亲脂性，容易在富含油脂的油茶籽仁进行富集。狄氏剂、七氯和毒杀芬为持久性接触和胃毒杀虫剂，可防治地下害虫及蚁类，用作土壤杀虫剂的艾氏剂是环境中狄氏剂(高达97%)的主要来源，当土壤含有丰富有机质时，艾氏剂能很快被土壤吸收并反应产生狄氏剂。

3 结论

建立了针对性净化与GC-MS/MS相结合的方法测定油茶果不同部位中55种持久性有机污染物。通过比较不同吸附剂，确定PSA、C18和NANO Carb用于油茶籽仁的净化，PSA和Pesticarb用于油茶外种皮的净化，PSA用于油茶壳的净化，方法学参数验证良好。将该方法应用于实际样品测定，平行性和准确度好，灵敏度高，适用于油茶果不同部位持久性有机污染物的检测，对其他油料作物的持久性有机污染物检测有一定的参考价值。