茶树G4基因克隆及其在白茶萎凋过程中的表达模式分析

ZARIPOV TIMUR，周承哲，2，谢思艺，田采云，石碧滢，朱 晨，2，郭玉琼*

（1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建福州350002；2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002）

茶树[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]作为一种重要的木本经济作物，具有极大的经济、药用和文化价值[1-4]。叶绿素具有吸收和传递光能的能力，在植物生长发育中起着重要作用，其含量是决定叶片颜色的关键因素[5-6]。高等植物中的叶绿素主要包括叶绿素a和叶绿素b，其中叶绿素a合成的最后一步是7-丙酸与C20聚异戊二烯醇叶黄醇的酯化反应，这一过程依赖于叶绿素a合成酶的作用[7]，目前已在拟南芥等植物中鉴定出其编码基因（G4）[8]，然而在茶树中尚未见有关G4基因的克隆研究。尽管叶绿素不溶于水，对茶汤的色泽影响较小[9]，但叶绿素的含量对干茶色泽品质仍然具有重要影响[10]。已有相关研究发现，叶绿素含量与白茶干茶色泽品质呈正相关[11-12]。白茶作为福建的特种茶之一，因其具有较强的保健功效而深受广大消费者的喜爱[13-14]。萎凋作为白茶加工过程中最关键的工艺，对白茶独特品质形成具有决定性影响[15-16]。白茶萎凋过程中茶叶受到脱水胁迫，从而影响叶绿素的降解，最终形成白茶灰绿的色泽[15]。为更好地了解白茶萎凋过程中叶绿素含量变化规律及叶绿素a合成基因G4对叶绿素含量的合成调控作用，该研究对茶树G4基因进行克隆并进行相关生物信息学分析。同时，对白茶萎凋过程中G4的相对表达量和叶绿素含量进行分析，以期为揭示G4在白茶萎凋过程中作用机理及其对叶绿素含量影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料来源。供试植物材料取自福建农林大学教学实践茶园（26°05′N，119°14′E）的‘福鼎大白’茶树品种。按照白牡丹白茶采摘标准，从8株长势一致，无病虫害的‘福鼎大白’茶树均一地采取一芽二叶茶树嫩梢用于后续分析。

1.1.2 主要试剂。DreamTaq Green Mix酶，T1载体，T1感受态细胞，GelGreen荧光核酸凝胶染色剂，DEPC-H2O，75%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 白茶萎凋处理。将茶叶置于室内进行48 h自然萎凋，摊叶厚度为1 cm，设置萎凋温度（25±2）℃，相对空气湿度60%±3%。每12 h（0、12、24、36、48 h）进行取样，每次取样进行3次生物学重复，共获得15份样品，并对所有样本的表型进行记录。将上述样品分别置于锡箔纸袋中，液氮固样后于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 叶绿素含量测定。叶绿素含量按北京索莱宝科技有限公司试剂盒说明书进行测定，称取叶片中段，称取0.1 g切成小块，用蒸馏水洗涤。样品在研钵中研磨，加入试剂后，转移到试管中，用80%（V/V）丙酮稀释至10 mL。在弱光条件下进行制备，试管在室温下置于黑暗处3 h，直到底部的组织残留物完全变白。用分光光度计测定叶绿素a（645 nm）和叶绿素b（663 nm）的吸光度。叶绿素a和b和总含量按下列公式计算：

其中，V代表上清液体积；F代表稀释倍数；m代表样品重量。

1.2.3 茶树总RNA提取及cDNA合成。参照TransZol-Up RNA提取试剂盒说明书（全式金，北京，中国）提供的方法从所有茶叶样品中提取总RNA。使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的完整性，并利用NanoDrop 2000紫外分光光度计（Thermo Scientific，威尔明顿，美国）检测其OD值，选取OD260/OD280值在1.8~2.0的RNA样本按照HifairRⅡ1st Strand cDNASynthesis Ki（t翊圣，上海，中国）说明书提供方案进行逆转录合成第一链cDNA用于CsG4克隆和qRTPCR分析。

表1 引物序列

1.2.4 CsG4的cDNA全长克隆。检索GenBank中已公布植物的G4序列，设计ORF全长验证相关引物（表1）。以‘福鼎大毫’茶树叶片cDNA为模板，进行PCR扩增。参照Lin等的方法，将扩增后的目的基因片段进行胶回收，T1为载体转入T1感受态中，挑选出阳性克隆子委托铂尚生物技术（福州）有限公司进行测序。

1.2.5 茶树CsG4序列分析。利用ExPASyProtParam对CsG4进行蛋白质基本理化性质分析；EMBnetTmpred、WoLFPSORT、SignaIP5.0Server、SOPMA以及STRING等在线工具分别用于蛋白跨膜区域预测、亚细胞定位、信号肽、蛋白质二级结构和蛋白互作关系分析；利用NetPhos3.1Server预测磷酸化位点、PONDR预测蛋白序列的无序区、Coils用于卷曲螺旋预测；并SWISS-MODEL用于模拟蛋白质三级结构；采用MEGA 7软件中的邻近相连法并设置bootstrap1000次重复以构建系统进化树。

1.2.6 qRT-PCR定量表达分析。利用DNAMAN软件设计CsG4异性引物进行qRT-PCR检测（表1）。进行qRT-PCR扩增，扩增结束后进行溶解曲线分析验证引物特异性，试验进行3次重复，采用2-△△Ct算法计算定量结果。

2 结果与分析

2.1 CsG4的cDNA克隆与序列分析

以‘福鼎大白’茶树叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，经电泳检测、胶回收纯化和测序后，获得CsG4的cDNA序列，该序列全长1 125 bp，共编码374个氨基酸（图1）。将CsG4在NCBI中进行blast比对，结果显示CsG4与杜鹃、大麻、咖啡、杨树和葡萄等多种植物的G4所编码的氨基酸序列具有84.1%以上的相似性，同源性较高。将CsG4氨基酸序列与茶树基因组氨基酸序列进行多序列比对，结果显示CsG4氨基酸序列与茶树基因组中转录本的氨基酸序列（TEA017076.1）相似度为82.9%（图2）。为进一步验证所克隆CsG4序列的正确性，利用‘福云六号’茶树叶片进行克隆，将克隆所得G4序列与CsG4序列进行多序列比对后发现，二者相似性为92.66%，表明所克隆的G4序列的正确性，但不同茶树品种之间可能存在序列差异。

图1 CsG4基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

2.2 CsG4编码蛋白特征

利用ExPASy ProtParam网站分析该基因编码蛋白的基本理化性质，结果表明CsG4相对分子量为40.49 kD，原子组成为C1872H2932N470O515S7，原子总数5 796；由20种氨基酸组成，其中Leu（14.4%）、Ala（10.2%）、Gly（8.6%）、Ser（7.0%）和Ile（6.7%）等5个氨基酸含量较为丰富，而His（0.8%）和Met（0.8%）这2种氨基酸含量最少，含有带负电氨基酸（Asp+Glu）共26个，带正电氨基酸（Arg+Lys）共30个；理论等电点（pI）为8.74；不稳定系数为25.76；总平均疏水性为0.313，推测该蛋白为稳定、疏水的酸性蛋白。

蛋白质的功能与结构密切相关，利用SOPMA在线分析工具预测CsG4蛋白的二级结构，结果显示其主要为49.47%α-螺旋、11.76%延伸链、4.55%β-转角和34.22%不规则卷曲结构（图3）。利用EMBnet-Tmpred预测蛋白跨膜区，结果显示CsG4蛋白存在7个跨膜区域（图4A），在93-113、169-187、223-240和317-339位氨基酸存在由内向外的蛋白跨膜区域，最高分值为1 747分；在120-138、195-213、224-270及355-374位氨基酸存在由外向内的跨膜区域，最高分值为1 753分，推测CsG4蛋白属于跨膜蛋白。利用WoLFPSORT和SignaIP5.0分别对CsG4蛋白进行亚细胞定位和信号肽分析（图4B），结果表明CsG4编码蛋白主要定位于叶绿体，不具有信号肽。利用NetPhos3.1对CsG4蛋白所含的磷酸化位点进行预测，结果显示（图5）该序列含有34个磷酸化位点，分别为15个Thr位点、14个Ser位点和4个Tyr位点，能被蛋白激酶C（PKC）和酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）等蛋白激酶磷酸化。利用PONDR在线预测软件对G4蛋白序列进行无序区预测，结果显示，无序区段主要位于1-2、13-37、43-60、80-98、155-164和373-374 6个区段，占比20.32%。利用Coils工具预测对CsG4蛋白卷曲螺旋形态进行预测，结果显示CsG4蛋白存在卷曲螺旋。利用SWISS-MODEL对CsG4蛋白进行三维结构预测，预测结果表明（图6A）CsG4蛋白主要结构元件为α-螺旋。通过STRING对CsG4蛋白潜在的互作关系进行预测分析（图6B），参照拟南芥蛋白质数据库，G4与AT1G74470和PCB2的互作系数分别为0.997和0.997，与ALB1的互作系数为0.995。

图2 CsG4氨基酸序列多重比对

图3 CsG4蛋白的二级结构预测分析

图4 CsG4蛋白跨膜区域预测及信号肽分析

2.3 CsG4氨基酸序列进化树分析

为进一步了解CsG4在不同物种间的进化关系，将CsG4蛋白与其他植物的G4蛋白进行氨基酸多序列比对，并利用MEGA7软件构建系统进化树。结果显示，茶树CsG4与杜鹃（Rhododendron dauricum）和咖啡（Coffea arabica）等植物的亲缘关系最近，与毛果杨（Populus trichocarpa）和杨树（Populus euphratica）的亲缘关系较远（图7）。

2.4 白茶萎凋过程中叶片表型变化

为了解白茶萎凋过程中叶片色泽的变化，对萎凋叶每隔12 h拍摄一次照片，发现茶叶中的水分含量不断减少。在48 h时，颜色从最初的黄绿色变为暗绿色，其中芽和第1片叶子的变化更为明显（图8）。

2.5 白茶萎凋过程中叶绿素含量变化分析

为了解白茶萎凋过程中叶绿素含量变化，对萎凋过程中‘福鼎大毫’茶树叶片中的叶绿素含量进行测定。结果表明，白茶萎凋48 h时，叶绿素含量比茶树鲜叶下降了近2倍。叶绿素a的降解率高于叶绿素b，chl a/chl b的相关性不断降低（图9）。

2.6 茶树CsG4在白茶萎凋中的表达分析

为了解CsG4在茶叶在萎凋过程中的表达水平，利用qRT-PCR技术对其表达量进行定量分析。结果显示，白茶萎凋过程中，CsG4的相对表达量显著降低，且与萎凋过程中叶绿素含量总体变化趋势呈正相关（图10）。这些结果表明，叶绿素含量和相关基因表达的降低可能是由采摘损伤和萎凋引起的脱水胁迫，推测可能是植物对胁迫产生了应激反应。

3 讨论

白茶萎凋过程中叶片绿色消失是由叶绿素降解引起的，因此对叶绿素合成相关基因进行分子克隆，了解其编码蛋白的理化性质及其在白茶萎凋过程中的表达具有重要意义。该研究表明，CsG4的cDNA序列，全长1 125 bp，共编码374个氨基酸，存在7个跨膜区域，且CsG4编码蛋白主要定位于叶绿体，不具有信号肽。以‘福鼎大毫’茶树叶片为材料对G4进行克隆，克隆所得序列与茶树基因组中CsG4氨基酸序列与茶树基因组中转录本序列（TEA017076.1）相似度为82.9%，为验证所克隆CsG4序列的正确性，利用‘福云六号’茶树叶片进行克隆，将克隆所得G4序列与CsG4序列进行多序列比对后发现，二者相似性为92.66%，进一步验证所克隆的G4序列的正确性。而这种差异可能是茶树品种差异导致的。

图5 CsG4蛋白所含的磷酸化位点

图7 CsG4系统进化树分析

图6 CsG4蛋白三维结构预测及蛋白互作分析

叶绿素代谢可能是影响白茶萎凋过程中叶色变化的关键因素。对白茶萎凋过程中茶叶中叶绿素含量进行测定后发现，叶绿素含量随萎凋时间延长总体呈下降趋势，这一变化规律与白茶凋萎过程中CsG4的表达量变化趋势一致。推测白茶萎凋过程中CsG4表达对叶绿素含量变化具有重要调控作用。

茶叶颜色是白茶品质的指标之一，因此更好地了解白茶萎凋过程中叶绿素代谢的机制值得深入研究。该研究以期为揭示CsG4在白茶萎凋过程中作用机理及其对叶绿素含量影响提供理论依据。

图8 白茶萎凋过程中叶片表型变化

图9 白茶凋萎过程中叶绿素含量变化

图10 白茶萎凋过程中茶树CsG4表达分析