miR-423-5p在牛肌肉组织中表达及其靶基因预测

陈 雯，张伟伟，2，*，邵淑丽，2，付学鹏，2，黄 鑫，2，李 铁，2

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

MicroRNA(miRNA)，一种非编码小分子RNA，其长度普遍为21～25个碱基。 这种小RNA广泛存在于各种真核生物中，并具有较高的保守性。miRNA主要通过促进靶基因的mRNAs发生降解或者抑制靶基因的翻译过程，对转录后水平具有负调控作用[1]。miRNA还参与细胞代谢、增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[2-3]。生物体内肌肉类型大致可分为心肌、平滑肌和骨骼肌三大类。心肌由成熟的心肌细胞组成，是心脏中特有的肌肉类型，其肌肉增殖分化能力较低[4]。平滑肌主要分布在血管、消化道、生殖道、呼吸道等组织中。当肺动脉平滑肌受到炎症、缺氧、创伤等刺激后，平滑肌细胞可参与肺血管的重塑[5]。另外有研究表明，胰岛素可促进小鼠结肠平滑肌细胞的增殖[6]，表明平滑肌细胞具有一定的增殖分化能力。骨骼肌是体内活跃度以及可塑性较高的一类组织，约占总体重的40%。骨骼肌形成是一个十分复杂的过程，涉及到骨骼肌卫星细胞和成肌细胞的增殖、分化和肌管形成[7]。

近年发现miRNAs在肌肉的生长和发育过程中发挥着极为重要的作用[8]。当血管壁受到损伤时，血管平滑肌细胞进入细胞周期开始增殖，在这个过程中有多种miRNAs参与调节该细胞的增殖与迁移。例如miR-92a通过靶向PTEN、miR-22通过靶向MECP2对血管平滑肌细胞的增殖以及迁移进行调控[9-10]。而miR-320d和miR-582则会促进人主动脉血管平滑肌细胞发生凋亡[11]。在骨骼肌细胞中同样有大量的miRNAs调控其生长发育过程，例如miR-1[12]与miR-206[13]在小鼠骨骼肌卫星细胞中均下调HDAC4基因的表达进而促进细胞的分化[7-8]；miR-486抑制Pax7表达加速肌源性分化的进程[14]。miR-133通过调节SRF[15]、MAML[16]、IGF-1R[17]基因的表达促进肌细胞增殖；在小鼠成肌细胞中miR-214既可以促进细胞的增殖又可以促进其分化[18]。miRNAs具有组织特异性。miR-1、miR-206、miR-133在骨骼肌细胞中特异性表达[19]。在骨骼肌发育过程中，miRNA具有阶段特异性。miR-133在成年猪的肌肉组织中表达高于胚胎中的表达水平；而miR-368、miR-376和miR-423-5p则在新生仔猪中的表达水平较高[20]。

miR-423是一个在人、小鼠、猪、牛等物种中相对保守的miRNA，能够形成miR-423-3p和miR-423-5p两种成熟序列。miR-423与多种疾病密切相关，如miR-423-5p可作为反映肝衰竭严重程度的分子标志[21]。在子宫内膜癌[1]、肝癌[13]、胃癌[22]、大肠癌[23]等细胞系和动物模型中miR-423-3p促进细胞的增殖、迁移和侵袭[23]。近几年有研究发现，miR-423与骨骼肌的生长发育具有一定的关系。miR-423与猪的骨骼肌的肌肉增殖、分化以及脂肪形成密切相关[24]，在猪骨骼肌不同的发育过程中miR-423-5p呈现出显著的表达差异，miR-423-5p可以抑制靶基因SRF对肌肉分化进行负向调控，并最终调控骨骼肌的生长发育[25]。同时miR-423具有调节成骨细胞生成的能力[26]，其通过靶向融合同源物的抑制剂最终达到抑制肌肉的生成的目的[12]。另外随着C2C12细胞的分化，miR-423-5p mRNA表达量呈明显的上升趋势[8，27]。这些无一不暗示着miR-423在细胞生长发育中具有重要的作用。

然而，miR-423-5p在牛肌肉组织中的表达及可能的作用尚不明确，因此，验证miR-423-5p在牛肌肉组织中的表达以及在不同分化天数的MDSCs中的表达，预测存在miR-423-5p潜在结合位点的靶基因，可为明确miR-423-5p在MDSCs细胞增殖分化中的作用提供前期的实验研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与组织

牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)由本实验室制备保存。骨骼肌、小肠、心脏组织取自黑龙江省双城市屠宰场健康成年西门塔尔牛，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 主要试剂

胎牛血清和马血清购自Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd公司。ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。TB Green®Premix Ex TaqTM购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

利用含有30%胎牛血清DMEM培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养MDSCs细胞。当细胞汇合达85%后，更换为含2%马血清的分化培养基进行分化处理，分别分化0、24和72 h，然后分别提取细胞的总RNA进行后续实验。

1.2.2 RNA提取以及荧光定量PCR

将牛各组织块在液氮中充分研磨后进行分装，同样将分化不同时间的细胞进行收集与分装。然后利用Trizol法提取总RNA，并利用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix以及茎环引物将其反转录成cDNA。然后利用TB Green®Premix Ex TaqTM进行荧光定量PCR，其反应体系为：TB Green Premix ExTaq5 μL，cDNA样品2 μL，上下游引物各0.5 μL，DEPC-treated H2O 2 μL。反应条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。反应结束后获得每个样品的Ct值，运用2-△△Ct法计算基因的相对表达。所用引物如表1所示。

1.2.3 miR-423-5p靶基因预测

通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)网站与miRBase 21.0 (www.miRbase.org)数据库查询牛miR-423成熟体(miR-423-3p和miR-423-5p)及前体序列(pre-miR-423)相关信息，然后利用在线软件TargetScan (http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://www.pictar.org/)预测可能与miR-423-5p结合的靶基因。

1.3 统计学分析

用GraphPad Prism 6将数据进行处理分析，实验数据以均数±标准差表示，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 miR-423在牛基因组中的位置及序列信息

为明确miR-423在牛基因组中的相关信息，本文查询了NCBI网站以及miRBase 21.0数据库上公布的牛miR-423(Gene ID: 791045)信息，结果如图1所示。miR-423位于牛基因组第19号染色体的21 238 007～21 238 100 bp处，为内含子miRNA。miR-423具有两种成熟序列分别为bta-miR-423-5p：UGA GGG GCA GAG AGC GAG ACU UU(长度为23 bp)；bta-miR-423-3p： AAG CUC GGU CUG AGG CCC CUC AGU(长度为24 bp)。其前体序列(pre-miR-423)为ATA AAG GAA GTT AGG CTG AGG GGC AGA GAG CGA GAC TTT TCT ATT TTC CAA AAG CTC GGT CTG AGG CCC CTC AGT CTT GCT TCC TAC CCC GCG C(长度为94 bp)，位于NSRP1基因的第一个内含子中。另外miRBase网站显示，bta-miR-423-5p的表达丰度明显高于bta-miR-423-3p，因此选择bta-miR-423-5p进行后续实验。

2.2 miR-423在各物种的同源性分析

通过查阅NCBI网站上公布的信息发现，miR-423在人(hsa)、鼠(mmu)、牛(bta)、猪(ssc)、马(eca)、山羊(chi)等25种物种中普遍存在。选取hsa、mmu、bta等含有miR-423-3p和miR-423-5p两种成熟序列的14个物种进行比较分析。miR-423在各物种的基因组中的位置见表2。在各物种之间pre-miR-423的同源性达66.96%(图2-A)，miR-423-3p同源性为95.83%(图2-B)，miR-423-5p的同源性为100%(图2-C)。

表1 bta-miR-423-5p引物序列及内参基因引物序列

图1 miR-423在牛基因组中的位置及序列信息Fig.1 miR-423 related information

表2 miR-423基因信息

续表2 Continued Table 2

2.3 miR-423-5p在牛肌肉组织中的表达

为明确miR-423-5p在牛不同肌肉组织中的表达情况，将提取的RNA利用茎环荧光定量PCR法对牛miR-423-5p的表达进行检测，结果如图3所示，小肠与骨骼肌中miR-423-5p的表达量明显高于心脏组织。

2.4 miR-423-5p在牛MDSCs分化过程中的表达

骨骼肌中含有大量的具有增殖分化潜力的骨骼肌卫星细胞(MDSCs)，因此进一步检测了miR-423-5p在MDSCs增殖分化中的表达变化。将MDSCs分别分化0 h(MDSC-P)、24 h (MDSC-D1)和72 h (MDSC-D3)，如图4所示，随时间的延长细胞分化现象明显，肌管数量明显增加；提取总RNA后采用茎环荧光定量PCR方法检测miR-423-5p的表达，结果如图5所示，随着分化时间的延长，miR-423-5p的表达量升高。

2.5 miR-423-5p靶基因预测

为了研究miR-423-5p在生物体内可能的作用机制，利用在线软件TargetScan和PicTar查询可能与miR-423-5p结合的靶基因。预测结果显示，大约有210个基因mRNA 的3′ UTR含有bta-miR-423-5p潜在的结合位点。再次利用TargetScan进行靶基因的反向筛选，筛选结果显示，在210个靶基因中有12个基因含有bta-miR-423-5p的结合位点。结果如表3所示。

** P<0.01; *** P<0.001.图5 miR-423-5p在MDSCs分化过程的表达Fig.5 Expression of miR-423-5p in MDSCs during differentiation

3 讨论

miR-423是一种广泛分布在各物种中的MicroRNA，然而在物种牛中与其相关的信息尚未见报道。因此，本文介绍了miR-423-5p在牛基因组中相关信息，并进行了与其他物种间的同源性分析。分析结果发现，牛(bta-miR-423)与人(hsa-miR-423)、鼠(mmu-miR-423)、猪(ssc-miR-423)等14个物种间的同源性达66.96%。另外对其两个成熟体进行分析比较，结果发现，miR-423-5p在各物种中的同源性高达100%，而miR-423-3p在各物种中的同源性则为95.83%。结果表明，miR-423无论是前体序列还是成熟体序列均显示为较高的种间保守性。

表3 miR-423-5p靶基因预测结果

miR-423-5p在细胞的生长发育中发挥着重要的调节作用，如在猪骨骼肌中其通过抑制SRF基因的表达进而负向调节细胞的分化[2]。由于miR-423-5p具有高度的保守性，基于此特性，本实验检测了牛肌肉中miR-423-5p的表达，结果表明，其在骨骼肌中表达量明显高于其他两种肌细胞。心脏中的心肌主要由成熟的心肌细胞组成，而该细胞具有较低的增殖分化的能力。小肠包括黏膜层和肌层，其中肌层主要由平滑肌细胞以及未分化的细胞组成，说明该组织具有一定的增殖分化的能力。众所周知，骨骼肌中含有大量的骨骼肌卫星细胞，该细胞具有较强的增殖分化的能力，结果显示，miR-423-5p在骨骼肌中表达量最高，不难看出其与细胞的增殖分化存在某种联系。有研究表明，在小鼠早期增殖的成肌细胞中观察到miR-423-5p出现明显上调，在肌源性分化4 d后达到最高水平[12]。本实验结果表明，miR-423-5p在分化的MDSCs中表达较高，且随时间的延长而升高，推测miR-423-5p可能促进MDSCs的分化，但其在细胞中的具体功能还需要进一步验证。

miRNA的“种子序列”是靶基因mRNA的3′UTR主要的结合位点，具有一定的调控作用[28]。为了能够进一步了解miR-423-5p在细胞中的作用及机制，利用TargetScan预测以及反向筛选了可能与miR-423-5p结合的靶基因，结果发现，在牛体内有12个基因mRNA的3′UTR具有miR-423-5p潜在的结合位点，其中部分靶基因参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程。如血小板反应蛋白基因家族成员3(Thbs3)，作为一种细胞外基质分子，THBSs家族成员参与了猪骨骼肌生长发育过程[29]。Ly6神经毒素1(Lynx1)是一种GPI-锚定蛋白。在人肺癌细胞中，通过siRNAs敲除Lynx1后促进了肺癌细胞的增殖，而Lynx1过表达则抑制了细胞的增殖[30]，这表明Lynx1是一种肺癌生长的内源性调节因子。神经生长因子诱导物(VGF)，一种由神经营养因子诱导的多肽，参与神经突的生长和神经保护[31]。在视神经细胞中当VGF基因被敲低时，细胞的增殖被抑制[32]。WNT基因家族成员9B(WNT9B)，是调节祖细胞增殖与分化平衡的关键因子。当细胞中的Six2被敲低时，Wnt9b/β-catenin则促进其分化[33]。在成年斑马鱼肾脏发育和再生中Wnt蛋白具有重要作用[34]。这些研究结果预示着miR-423-5p可能参与细胞的增殖分化过程，然而这些靶基因究竟是否能够与miR-423-5p结合还需进一步实验验证；而这些靶基因在牛骨骼肌中的作用同样需进一步的验证。