孕哺期摄入氧化乳蛋白对子代小鼠机体氧化还原状态的影响

莫 玲，香庆文，李晶晶，叶玉萍，赵超超

(桂林医学院 公共卫生学院， 广西 桂林 541004)

蛋白质是孕哺期非常重要的营养物质，该时期摄取的蛋白质的质量直接关系到母婴健康，尤其在对胎儿的健康非常重要。原乳及乳制品中含有较多的不饱和脂肪酸、氧化酶和金属催化剂类等成分，可能会在加工和贮藏过程中诱导乳蛋白发生氧化，使其理化性质发生变化，从而影响营养品质，甚至可能会产生有害化合物[1-4]。前期研究证实，孕哺期摄入氧化乳蛋白膳食后，子代小鼠肠道抗氧化防御能力和学习记忆能力均受到影响[5-6]。在乳制品中，脂肪和蛋白质都是非常重要的营养成分，乳脂肪氧化对乳制品的影响已被大众所接受，但是乳蛋白氧化尤其是乳脂肪氧化与乳蛋白氧化之间的关系及对机体的影响仍未引起大家的关注。Ventanas等[7]和Soyer等[8]研究发现，脂质氧化产物与蛋白质氧化产物有明显的相关性，脂肪的氧化会促进蛋白质氧化，而蛋白质氧化往往也会伴随着脂肪的氧化[9]。前期研究证实，脂肪含量降低，蛋白质氧化程度下降[10]。目前，孕哺期膳食中，饲喂不同脂肪含量的氧化乳蛋白对子代小鼠氧化还原状态及健康状况研究较少，本研究希望通过建立孕哺期不同脂肪含量的氧化蛋白饮食小鼠模型，系统研究氧化乳蛋白对子代小鼠氧化还原状态的影响，为孕哺期的饮食提供一定理论指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶，市售纯牛奶；HCl、NaOH、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三氯乙酸(trichloroethanoic acid，TCA)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase，CAT)、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，HNE)试剂盒，厦门慧嘉生物有限公司；KM小鼠SCXK桂2013-0001，桂林医学院实验动物中心。

1.2 仪器与设备

DW- 86L828J型医用超低温冰箱，青岛海尔特种电器有限公司；S- HH- W21- 600S型电热恒温三用水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司；Elx808型多功能酶标仪，赛默飞世尔科技有限(中国)有限公司；DD5型台式乳脂离心机，湖南赫西仪器有限公司；CTFD- 12S型冷冻干燥机，青岛永合创信电子科技有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1氧化乳蛋白制备

1.3.1.1 全脂氧化乳蛋白制备

全脂乳蛋白质量浓度为3.2 g/100 mL，将0.05 mol/L、pH=7.4的磷酸盐缓冲液与全脂乳混合制备成蛋白质含量为20 mg/mL的溶液，置于烧杯中，在100 ℃条件下水浴加热90 min，加热期间用玻璃棒连续搅拌。冷却后冷冻干燥处理，于-20 ℃保存、备用。采用凯氏定氮法测定冻干乳粉中蛋白质质量分数是20.3%。

1.3.1.2 低脂氧化乳蛋白制备

将全脂乳加热至40 ℃，在转速5 000 r/min条件下离心30 min，去除上层乳脂得到低脂乳，将0.05 mol/L、pH=7.4的磷酸盐缓冲液与低脂乳混合制备成蛋白质含量为20 mg/mL的溶液，置于烧杯中，在100 ℃条件下水浴加热90 min，加热期间用玻璃棒连续搅拌。冷却后冷冻干燥处理，于-20 ℃保存、备用。采用索氏抽提法测定其脂肪密度为1.9 g/100 mL。采用凯氏定氮法测定冻干乳粉中蛋白质质量分数是24.6%。

1.3.2乳蛋白氧化指标的测定

以未经氧化的纯牛乳为空白对照组，测定全脂氧化乳蛋白和低脂氧化乳蛋白样品中羰基、游离巯基含量。游离巯基含量测定按照Boatright的方法[11]，羰基含量测定按照Oliver的方法[12]。

1.3.3实验小鼠的饲养

清洁级KM小鼠，雄性9只，雌性18只，7周龄，体重20～22 g。在无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房观察室以正常饲料预饲1周，观察其体重、粪便、进食、饮水、活动状态等情况，剔除病弱小鼠后按体重随机分为3组，每组小鼠雌雄比例为2∶1合笼，以发现阴栓作为合笼成功依据。合笼成功后饲喂氧化乳蛋白日粮，以未做氧化修饰的乳蛋白制备空白对照组饲料；饲养3周后，繁殖产生子代小鼠，持续饲喂哺乳期雌性小鼠氧化乳蛋白日粮3周，子代小鼠断乳，隔离并对各组子代小鼠进行组织样本采集。各组日粮乳蛋白含量相同，配方见表1(日粮配方按照GB 14924.3—2001《小鼠繁殖饲料营养成分》要求配制)。各组小鼠同室分笼饲养，保持卫生清洁、自由饮食、饮水，温度(23±2)℃，湿度60%，自然光照。

背景介绍：2018年11月14日，邢福义先生《寄父家书》出版座谈会在北京商务印书馆文津厅召开。邢先生的老朋友陈章太、戴庆厦、商务印书馆总经理于殿利、华中师范大学原副校长黄永林、华中师范大学北京校友会会长李宇明、《光明日报》国学版主编梁枢等出席，陆俭明、张振兴、周海清、田小琳等知名学者发来视频或书面发言。座谈会由商务印书馆总编辑周洪波主持。

表1 孕哺期雌性小鼠日粮配方Tab.1 Diet formulation of female mice during gestation and lactation

1.3.4组织样本的采集

子代小鼠禁食12 h，称重，乙醚轻微麻醉，立即解剖，腹主动脉取血，将所取血液置于预先用肝素钠处理的离心管内，-80 ℃保存、待测。然后取小鼠的肠、肝、肾、脑称重，将所取出的各组织于冰浴条件下加入生理盐水制成质量分数为10%的匀浆液，-80 ℃保存，用于测定氧化还原指标。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件统计分析，结果以“平均数±标准差”表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 脂肪含量对牛乳中蛋白质氧化的影响

羰基是蛋白质氧化的一个比较显著变化，而且相对来说较易测量[13]。蛋白质的变性作用会导致羰基含量的升高，且在氧化过程中，蛋白质羰基化的产生是不可逆的[14-15]。一般情况下蛋白质中羰基衍生物形成主要有以下4个途径[16]: 1、肽骨架的断裂; 2、氨基酸侧链的直接氧化; 3、结合非蛋白羰基化合物; 4、与还原糖发生反应。有研究表明，氨基酸侧链易受自由基攻击产生，氨基酸残基氧化形成的羰基会导致蛋白质功能丧失[17-19]，所以羰基被广泛用于测量不同氧化作用下, 蛋白质损伤的程度。

对脂肪含量不同的牛乳进行氧化修饰，冻干乳粉的乳蛋白中羰基含量结果见图1。由图1可知，与未经加热氧化的空白对照组牛乳相比，经氧化修饰后全脂组和低脂组乳蛋白的羰基含量升高；全脂组和低脂组相比，低脂组羰基的含量低于全脂组。结果表明，不同脂肪含量的乳蛋白氧化都会导致乳中羰基含量变化，脂肪含量越高，乳中羰基含量越高。

**表示差异极显著P<0.01。图1 脂肪含量对牛乳氧化修饰蛋白中羰基含量的影响Fig.1 Effect of fat content on carbonyl content in oxidized milk protein

蛋白质中的巯基基团是十分活泼的，且具有很高的抗氧化活性。吴伶艳等[20]等证实了经过MDA氧化修饰后，大豆蛋白中的巯基减少、羰基化合物增加，且经电泳实验证明经过MDA 氧化修饰后大豆蛋白发生聚集现象，使得大豆蛋白溶解度出现显著性下降。对脂肪含量不同的牛乳进行氧化修饰，乳蛋白中巯基含量结果见图2。结果表明，不同脂肪含量的乳蛋白经氧化修饰后，与空白组对比，全脂组和低脂组乳蛋白的巯基含量明显下降(P<0.05)；全脂组和低脂组相比，全脂组巯基含量比低脂组低。实验结果表明不同脂肪含量的乳蛋白氧化都会影响巯基的变化，且随着脂肪含量上升，乳蛋白中巯基含量越低。结果与前期实验结果一致[10]。

*表示与空白组对比差异显著P<0.05。 图2 脂肪含量对牛乳氧化修饰蛋白中巯基含量的影响Fig.2 Effect of fat content on sulfhydryl content in oxidized milk protein

2.2 孕哺期摄入氧化乳蛋白的影响

2.2.1对子代小鼠体内脂质过氧化物的影响

经过对子代小鼠肠、肝、肾和脑中的MDA与HNE测量，与饲喂未添加氧化乳蛋白日粮的雌性小鼠相比，发现MDA和HNE在子代小鼠体内积累，实验结果分别见图3和图4。与空白对照组(饲喂未添加氧化乳蛋白日粮的雌性小鼠)相比，饲喂添加氧化乳蛋白日粮的全脂组与低脂组MDA和HNE含量明显升高；全脂组与低脂组相比，全脂组MDA和HNE含量比低脂组高。这表明随着脂肪含量的升高，MDA和HNE在机体内聚集越严重。实验结果证明在孕哺期摄食氧化修饰不同脂肪含量乳蛋白日粮后，子代小鼠机体受到明显的损伤。

*表示与空白组对比差异显著P<0.05。图3 孕哺期饲喂含氧化乳蛋白乳粉日粮对子代 小鼠组织中MDA含量的影响Fig.3 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on MDA content in tissues of offspring mice during gestation and lactation

*表示与空白组对比差异显著P<0.05，** 表示差异极显著P<0.01。图4 孕哺期饲喂含氧化乳蛋白乳粉日粮对子代 小鼠组织中HNE含量的影响Fig.4 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on HNE content in tissues of offspring mice during gestation and lactation

2.2.2对子代小鼠体内氧化还原酶活力的影响

在一般情况下，机体体内的氧化还原酶系统能抑制自由基的产生，维持细胞正常的生理功能。常见的机体内氧化还原酶有CAT、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶。

CAT是一类以过氧化氢为专一底物的酶，存在于动物的各个组织中，尤其是在肝脏中。它能促使自由基上的电子发生转移，而且使其分解成氧和水，进而抵御自由基伤害机体。

*表示与空白组对比差异显著P<0.05，** 表示差异极显著P<0.01。图5 孕哺期饲喂含氧化乳蛋白乳粉日粮对子代 小鼠组织中CAT活性的影响Fig.5 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on CAT activity in tissues of offspring mice during gestation and lactation

SOD在抑制机体氧化防御系统中起到了非常重要的作用。机体抵御自由基的第一防线是SOD，在超氧阴离子产生后，其产生的连锁反应会损害机体的细胞。通过在孕哺期饲喂氧化乳蛋白日粮3周，经过对子代小鼠肠、肝、肾和脑中的CAT与SOD测量，实验结果分别见图5、图6。与空白组相比，全脂组与低脂组的各组织中CAT和SOD含量明显下降；全脂组与低脂组相比，全脂组的CAT和SOD比低脂组含量低；说明随着脂肪含量的升高，机体中CAT和SOD的含量明显下降。实验结果表明孕哺期饲喂经氧化修饰不同脂肪含量乳蛋白日粮后，子代小鼠肠、肝、肾和脑的氧化还原酶活力均有不同程度的降低。

*表示与空白组对比差异显著P<0.05，** 表示差异极显著P<0.01。图6 孕哺期饲喂含氧化乳蛋白乳粉日粮对子代 小鼠组织中SOD活性的影响Fig.6 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on SOD activity in tissues of offspring mice during gestation and lactation

3 结 论

孕期和哺乳期是子代各组织器官发育的关键时期，该时期的营养变化尤其是作为生命物质基础的蛋白质对后期婴幼儿的整体发育有密切的联系。研究结果表明氧化修饰不同脂肪含量乳蛋白中羰基和巯基的含量产生了变化，在雌性小鼠孕哺期摄入氧化修饰脂肪含量不同的乳蛋白后，子代小鼠也受到了影响。从实验结果可以看出，与未经加热氧化的牛乳相比，全脂组与低脂组羰基含量升高，巯基含量降低。孕哺期饲喂氧化修饰不同脂肪含量乳蛋白日粮后，子代小鼠氧化还原酶活力降低、MDA和HNE在子代小鼠体内积累。说明孕哺期摄入氧化修饰脂肪含量不同的乳蛋白会引发子代小鼠氧化还原状态的改变，且脂肪含量越高，状态改变越明显。原因可能是脂肪氧化产生大量自由基，从而诱导蛋白质发生氧化；另外，脂肪氧化产生的大量的脂质过氧化物也会攻击蛋白质，引起蛋白质的氧化[24]，蛋白质氧化产物在机体积累从而引起子代小鼠的氧化还原状态失衡[25-27]。为避免这种状态的发生，在乳制品加工中，可以考虑通过将乳脂肪与乳蛋白分离来降低因氧化造成的乳制品营养价值的损失。本研究可以为了解不同脂肪含量乳蛋白对机体产生的影响以及对孕哺期的饮食提供一定的理论依据，但脂肪对蛋白质氧化影响及对子代机体影响的相关机制还有待进一步的研究。