碱处理结合盐辅助分散液液微萃取GC-MS/MS检测即食鱼制品中7种N-亚硝胺

侯彤瑶，王宗义，潘晓玉，张丽萍，刘 珊，吴天俁

(北京农学院 食品科学与工程学院/食品质量安全北京实验室/农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室， 北京 102206)

N-亚硝胺(N-nitrosamines)是一类重要的致癌性食品污染物[1]，主要由亚硝酸盐和胺类物质作用生成[2-3]。调查显示，鱼类加工食品容易受到此类物质的污染[4]，其食品安全风险值得关注。我国水产动物食品中N-二甲基亚硝胺(NDMA)的安全限量为4 μg/kg[5]，其他N-亚硝胺类物质，尚未规定限量。

目前，检测样品中痕量N-亚硝胺的有效方法，主要是色谱与串联质谱[6-8]或高分辨质谱[9]的联用技术。由于食品基质相对复杂，目标物含量低，通常N-亚硝胺的检测需要对样品进行有效提取、净化和浓缩，且还需要有效控制部分目标物的挥发损失；而经典的水蒸气蒸馏- 液液萃取- 氮吹浓缩方法[10]则较为费时费力, 批量样品筛查检测的压力较大。分散固相萃取[11]、活性炭柱固相萃取[12-13]、QuEChERS技术[4,14-15]和分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)[16-18]是近年来报道的较为有效的改进方法。其中DLLME是将微升级高密度提取剂，在分散剂的作用下分散到样品溶液中，形成乳浊液，从而扩大相界面，实现高效萃取，离心分离萃取剂后，样品直接用于检测的方法。DLLME具有成本低、操作简单、富集倍数大和环境污染小的特点[19]；但经典DLLME方法常用的四氯化碳、三氯甲烷等提取剂，毒性仍相对较大，并且四氯化碳对N-亚硝胺等极性相对较大的化合物萃取效果较差。研究报道，在高浓度盐辅助和不使用分散剂的条件下，毒性相对较低、极性稍大的二氯甲烷也可做萃取剂，其与水溶液形成乳浊液，实现对极性相对较大的目标物的有效萃取，即盐辅助分散液液微萃取(salt-assisted dispersive liquid-liquid microextraction, SADLLME)方法[20]，从而补充了经典DLLME方法的不足。但关于使用SADLLME检测N-亚硝胺的方法还少有报道。

本研究利用氢氧化钡溶液处理法将N-亚硝胺转移至水溶液，进一步优化SADLLME参数，再结合气相色谱- 串联质谱法(GC-MS/MS)的高选择性、高灵敏性和同位素内标定量的准确性，旨在建立一种针对即食鱼制品的样品前处理简单、成本低廉，对人员、环境更为友好的适合7种N-亚硝胺的SADLLME-GC-MS/MS检测新方法，希望为简化食品中N-亚硝胺检测方法提供新的借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

即食鱼制品，北京地区超市；50 mL塑料离心管，BD Biosciences公司。

分析纯八水合氢氧化钡、硫酸钠、四氯化碳、三氯甲烷等，国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷、甲醇，色谱纯，美国J.T.Baker公司；质量浓度2 000 mg/L的7种N-亚硝胺的混合标准溶液，美国O2si公司；质量浓度1 000 μg/mL的N-亚硝二甲胺-d6(NDMA-d6)、N-亚硝二丙胺-d14(NDPA-d14)、N-亚硝基吡咯烷-d8(NPYR-d8)的甲醇溶液，美国Accustandard Inc公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C型气相色谱- 串联质谱联用仪、量程为1.0 mL精密注射器，美国Agilent Technologies公司； Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；MS200型自动多管涡旋混匀仪，杭州瑞诚仪器有限公司；800A型样品均质机，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1标准溶液的配制

定值混合标准溶液和3种定值内标溶液，分别经甲醇稀释得到200 μg/mL的混合标准储备液和100 μg/mL的混合内标储备液(棕色贮液瓶，-18 ℃储存)，再进一步稀释至质量浓度分别为1.0、0.1 μg/mL的混合标准中间工作液和质量浓度均为1 μg/mL的NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8内标混合液。最后，用二氯甲烷稀释，得到质量浓度为1、5、10、25、50、100 ng/mL和内标质量浓度为50 ng/mL的系列标准工作液。

1.3.2样品前处理

1.3.2.1 样品的提取

称取经均质的即食鱼干样品5.0 g于50 mL塑料离心管中，加入1 μg /mL的3种稳定同位素内标混合溶液50 μL，静置5 min，加入1 g氢氧化钡，35 mL纯水，拧紧盖子，混匀涡旋30 s，于90 ℃烘箱中处理2 h(处理30 min时取出涡旋混匀1次)。取出稍冷，直接置于离心机中8 000 r/min离心10 min，上清液完全倾入另一预先装有7 g硫酸钠的50 mL的离心管中，拧紧盖子，手动摇匀至反应充分，再于8 000 r/min离心10 min，上清液完全倾入另一50 mL的离心管中备用。

1.3.2.2 SADLLME处理

注射器吸取500 μL二氯甲烷，快速打入1.3.2.1节中溶有硫酸钠的样品提取液中，形成乳浊液，并于自动多管涡旋混合器上涡旋5 min，再以8 000 r/min离心10 min, 弃去部分体积的水相后，移液枪吸取下层二氯甲烷100 μL于带有体积为200 μL内插管的进样瓶中待测。

1.3.2.3 加标回收实验样品处理

按1.3.2.1节的方法称取样品后，分别加入0.1 μg/mL的混合标准溶液50 μL，1 μg/mL的混合标准溶液25、50 μL和1 μg/mL内标混合溶液各50 μL，即加标水平分别为1、5、10 μg/kg，再继续按1.3.2.1节和1.3.2.2节方法进行处理，每个水平重复6次。

1.3.3分析条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：DB-WAXUI色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm )；升温程序：初始温度35 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至90 ℃，30 ℃/min 升至240 ℃保持6 min；载气(He)流速0.9 mL/min，恒流模式；进口样温度190 ℃，进样量1 μL，不分流进样；溶剂延迟5 min。

1.3.3.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采集模式为多重反应监测模式(MRM)，参数见表1。

表1 N-亚硝胺的MRM参数Tab.1 MRM parameters of N-nitrosamines

1.3.4定性、定量方法

定性分析通过核对目标物与相应标样的保留时间、前级离子、碎片离子及丰度比进行；定量分析使用内标法，其中NDMA以NDMA-d6为内标，NDEA和NPYR以NPYR-d8为内标, 其他均以NDPA-d14为内标。

1.4 数据处理

数据处理使用MassHunter B.07.01软件和Microsoft Office Excel 2013进行。

2 结果与分析

2.1 提取方法的确定

SADLLME方法需要样品中目标物有效转移至水溶液中，对于即食鱼制品，有效的提取方法有水蒸气蒸馏[11]、高压热水处理[21]、氢氧化钠溶液(或含甲醇)[18]或饱和氢氧化钡溶液皂化处理[13]；其中水蒸气蒸馏费时、费力，高压水处理需专门的设备，碱溶液皂化处理相对简单；而使用饱和氢氧化钡溶液则更为简单，样品溶液不黏稠，不需使用蛋白沉淀剂处理，仅需加入一次固体氢氧化钡即可完成。本研究在使用氢氧化钡处理的基础上[14]，离心后加入过量硫酸钠，再经离心除去生成的硫酸钡，使样品溶液得到进一步净化，同时过量的硫酸钠可作为下一步SADLLME方法的盐辅助剂，有效简化了样品提取方法。

2.2 辅助用盐的确定及用量的优化

为便于观察乳浊液的形成情况，研究首先使用30 mL盐浓度均为1 mol/L的水溶液(N-亚硝胺加标量100 ng)，按1.3.2.2节的方法比较了硫酸钠、氯化钠、碳酸钠和磷酸二氢钠4种常用盐的效果。结果显示：4种盐均能促使二氯甲烷与水溶液形成乳浊液，响应值除氯化钠最低外，其他盐均有足够的强度，但以硫酸钠最高，见图1。这主要是相同物质的量浓度下，氯化钠溶液的离子强度最小，盐析效应较差。考虑使用硫酸钠容易获得较大的离子强度，同时可与样品提取液中的氢氧化钡形成硫酸钡沉淀，有辅助进一步净化样品溶液的作用，故本研究以硫酸钠为辅助用盐。

图1 不同辅助用盐的效果比较Fig.1 Comparison of effects of different auxiliary salts

实验进一步按1.3.2.1节方法对硫酸钠用量进行了优化，结果见图2。当硫酸钠用量为5～7 g时，响应值趋于平稳，进一步提高硫酸钠用量时，溶液达到饱和，会有结晶沉淀析出，不利于萃取剂的分离。考虑沉淀钡离子需要消耗一定量硫酸钠，故确定用量为7 g。

图2 硫酸钠用量的优化Fig.2 Optimization of sodium sulfate dosages

2.3 萃取剂体积的优化

同样使用1.3.2.1节得到样品溶液(加标量为100 ng)对二氯甲烷体积进行了考察，结果见图3。当二氯甲烷用量小于200 μL时，离心后体积过小；用量为300～600 μL时，目标物响应值变化不大。为便于离心后取出和自动进样分析(体积需大于50 μL)，确定二氯甲烷用量为500 μL。

图3 二氯甲烷用量的优化Fig.3 Optimization of dichloromethane dosages

pH值亦对N-亚硝胺的萃取有影响，但影响不十分显著[17]。由于酸性条件有利于可能存在的胺和亚硝酸盐反应形成新的N-亚硝胺[2]；但本研究的样品溶液为碱性，故未对pH值的影响进一步讨论。

2.4 SADLLME与DLLME萃取效果的比较

使用1.3.2.1节处理得到的样品溶液(加标量为100 ng，其中用于DLLME的样品溶液不加硫酸钠)，分别进行SADLLME和DLLME[19-20]，其中DLLME使用三氯甲烷和乙醇、四氯化碳和甲醇分别做萃取剂和分散剂，每组平行测定4次，见图4。结果显示：同等实验条件下，SADLLME方法的萃取效果总体优于经典的DLLME方法。

图4 SADLLME与DLLME方法萃取N-亚硝胺 效果的比较Fig.4 Comparison of SADLLME and DLLME for extraction effects of N-nitrosamines

2.5 SADLLME方法对色谱和质谱检测的影响

考察3种不同品牌的鱼干制品，发现在本研究确定的碱处理结合SADLLME方法和优化的色谱分离与质谱检测条件下，各类N-亚硝胺均不受共同流出物的干扰，典型MRM色谱见图5。

图5 标准品及一种鱼干样品的MRM色谱Fig.5 MRM chromatograms of standards and one dried fish sample

2.6 检出限、定量限、线性关系和回收率分析

检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别在定性离子色谱峰可有效识别的前提下，以实际样品和低水平加标样品分析物的信噪比约为3和10进行评估[22]，结果见表2。LOD为0.10～0.19 μg/kg，LOQ为0.28～0.56 μg/kg，参照水产品中NDMA安全限量4 μg/kg，本方法的检出能力满足N-亚硝胺监测的需要。根据样品SADLLME萃取液的目标物可能质量浓度，对1～100 ng/mL的系列标准溶液进行考察，线性良好，R2>0.997。根据实际即食鱼制品中N-亚硝胺的含量水平，进行1、5、10 μg/kg的加标回收实验，回收率为79.19%～117.40%，相对标准偏差(RSD)为1.06%～10.30%，见表3。

表2 目标物的线性关系、检出限和定量限Tab.2 Linearity，limits of detection and limits of quantitation of analytes

表3 样品中7种N-亚硝胺的回收率及精密度Tab.3 Recoveries and precisions of seven N-nitrosamines in samples

2.7 实际样品的检测结果

应用本方法对购自本地超市的3种即食鱼制品进行检测，除NPYR未检出外，其他N-亚硝胺均被不同程度检出，其中NDMA质量分数为4.21～8.84 μg/kg，与文献[4]报道类似，其他N-亚硝胺含量介于LOD和LOQ之间。

3 结 论

本研究建立了氢氧化钡处理-SADLLME结合GC-MS/MS检测即食鱼制品中7种N-亚硝胺的新方法。该方法具有样品前处理简单，成本低廉，灵敏、可靠的优点，能够满足相关食品中N-亚硝胺检测的需要，以期为相关食品的安全监测提供方法和借鉴。