EGFR外显子19缺失突变促恶性甲状腺肿瘤侵袭迁移作用的研究

张晶晶，夏玉娟，董顺利，张 熠

（苏州大学药学院，江苏 苏州 215123）

甲状腺癌占所有人类恶性肿瘤的0.5%～1%[1]，并且其发病率以每年5%～6%的速度持续上升[2]，临床上治疗包括滤泡型甲状腺癌（follicular thyroid cancer, FTC）、未分化甲状腺癌（anaplastic thyroid carcinoma, ATC）、低分化甲状腺癌（poorly differentiated thyroid cancer, PDTC）在内的恶性甲状腺肿瘤，主要以手术以及手术后放射治疗或放疗与化疗联合的方式[2]，目前没有很好的靶向治疗手段[3]。可见，积极探索甲状腺癌发生的分子机制可为靶向晚期或复发甲状腺癌提供理论依据，改善患者的预后。

在晚期甲状腺癌中，表皮生长因子受体（EGFR）通常过表达[4]。EGFR与甲状腺癌的侵袭性和进展有关[5]，也可积极参与甲状腺癌晚期和远处转移，表现为EGFR染色强度与乳头状甲状腺癌（papillary thyroid cancer, PTC）的复发具有显著相关性[6]。除过表达之外，EGFR突变也在甲状腺癌中被发现。据报道，在1 例PTC患者中检测到EGFR外显子19的缺失突变（EGFR 19del）[7]；在1 例ATC患者中检测到EGFR外显子21 L858R突变[8-9]。因此，以EGFR为靶点的分子治疗可能是表达EGFR的甲状腺癌的合适选择。

本研究旨在探讨EGFR外显子19缺失突变在甲状腺癌中的作用，研究外显子19缺失突变的侵袭性行为，分析其在甲状腺癌中的可能作用通路，讨论EGFR外显子19缺失突变是否可以成为甲状腺癌患者有效治疗的靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞株 甲腺滤泡上皮细胞株（HTFEC）和稳定转染EGFR外显子19缺失突变的细胞株（HTFEC-ex19 del）培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素（双抗）和含有0.4 μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基（含谷氨酰胺），在37 ℃，5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，2～3 d换液，在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2 实验方法

1.2.1 划痕实验：对六孔板底部进行标记，待细胞密度长至90%左右时，10 μL移液枪枪头对细胞进行竖直划痕，PBS洗涤细胞后加入无血清的细胞培养液，于倒置显微镜下拍摄并记录0 h的初始细胞划痕面积。将细胞放在5% CO2，37 ℃的培养箱中继续培养。之后于指定时刻内，再次用倒置显微镜进行拍摄。以伤口修复面积百分比（%）＝(初始细胞划痕面积－某时刻的面积)/原始面积×100%，测定细胞运动能力。

1.2.2 Transwell侵袭和迁移实验：对于迁移实验，将细胞悬浮在无血清的细胞培养基中，缓慢加入到Transwell小室的上室（1×104个/室），下室加入含血清的正常培养基。对于侵袭实验，用DMEM稀释过的基质胶（8:1）包被Transwell小室的上室，放入37 ℃培养箱中使基质胶固化1 h。48 h后，用棉签小心擦去膜内侧细胞，室温下4%多聚甲醛固定20 min，之后用含0.5%结晶紫70%乙醇溶液染色30 min，显微镜下拍摄（40×），并进行计数。

1.2.3 Western Blot：提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整上样量，加入Loading Buffer，100 ℃变性10 min。使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，之后将蛋白转移到NC膜上，封闭后，孵育一抗、二抗。使用Odyssey双色红外激光成像仪进行扫描，采集图像。

1.2.4 转录组测序分析（RNA-seq）：从HTFEC和HTFEC-ex19 del细胞中分别提取总RNA。按照制造商的说明，使用NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina®制备RNA-seq文库。进行检测，结果按照差异基因表达变化倍数（fold change,FC）变化2倍以上且错误发现率（FDR）≤0.05为标准，产生P＜0.05的差异表达基因热图，并进行相应的通路分析和基因功能分析，例如GSEA（gene set enrichment analysis）分析。

1.3 统计分析 采用GraphPad Prism 7软件对实验结果进行统计分析并制作图表。所有实验数据以均值±标准误表示，采用Student'st-test进行统计分析，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR外显子19缺失是甲状腺肿瘤患者中的一种潜在突变类型 我们收集了50 例包括FTC、髓样甲状腺癌（medullary thyroid carcinoma, MTC）、PDTC或ATC在内的各种类型甲状腺癌患者标本（图1A）。基因测序分析显示，2 例（4%）患者存在EGFR突变（图1B），其中包括1 例EGFR 19 del（19号外显子缺失突变）和1 例EGFRY112X突变（3号外显子）。

图1 EGFR外显子19缺失是甲状腺肿瘤患者中的一种潜在突变类型A：50 例各种类型的甲状腺癌患者样本癌种分布；B：甲状腺癌中常见的驱动基因及检出情况。Fig.1 The deletion of EGFR exon 19 is a potential mutant type in thyroid-derived cancer patientsA: Distribrtion of cancer types of 50 samples of malignant thyroid carcinima; B: Detection of the common driver gene in thyroid cancer.

由于在我们的标本中发现4%（2/50）的患者存在EGFR突变，且其中1 例为19号外显子缺失突变，表明这并不是偶然事件。接下来，我们探究EGFR 19号外显子缺失突变在甲状腺癌发生发展中的生物学功能特性。

2.2 HTFEC外显子19缺失的细胞迁移侵袭能力增强 癌细胞进行迁移和侵袭的能力是恶性肿瘤细胞的重要表型[10]，因此，我们检测了EGFR外显子19缺失突变对细胞迁移和侵袭的影响。划痕实验检测细胞的迁移能力，结果显示，与对照组相比，在表皮生长因子（EGF）刺激下HTFEC-ex19 del组能够以更快的速度愈合，并且迁移至Transwell小室底部的细胞数更多；Transwell实验检测细胞的侵袭能力，在EGF刺激下，HTFEC-ex19 del细胞穿过基质胶的数量显著多于对照组。此外，使用一代EGFR TKI（Gefitinib）处理可显著抑制HTFEC-ex19 del细胞的迁移和侵袭（图2A-C）。

图2 HTFEC-ex19 del细胞的迁移侵袭能力增强A：划痕实验检测细胞迁移能力，EGF（20 ng/mL），Gefitinib（50 nmol/L）（标尺长度：50 μm）；B：Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力，EGF（20 ng/mL），Gefitinib（50 nmol/L）（标尺长度：50 μm）；C：图A的统计图，n＝3，**P＜0.01；D：图B的统计图，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。Fig.2 The abilities of migration and invasion in HTFEC-ex19 del cells were enhancedA: Cell migration ability was detected by Wound Healing. EGF (20 ng/mL), Gefitinib (50 nmol/L) (Scale length: 50 μm); B: The abilitise of migration and invasion were detected by Transwell. EGF (20 ng/mL), Gefitinib (50 nmol/L) (Scale length: 50μm); C:The statistical graph of Figure A. n＝3，**P＜0.01; D: The statistical graph of Figure B，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01.

以上结果表明，EGFR外显子19缺失突变以EGF依赖性方式显著诱导甲状腺癌细胞的迁移和侵袭，EGFR TKI可有效抑制这一现象。

2.3 GSEA富集分析EGFR外显子19缺失突变在甲状腺滤泡上皮细胞恶性行为中驱动的分子通路 为了深入了解EGFR外显子19缺失在甲状腺滤泡上皮细胞促侵袭转移中选择性驱动的分子通路，我们进行了GSEA富集分析。富集分析发现，EGFR下游的PI3K-AKT-MTOR信号通路、上皮间质转化途径、p53途径致癌和KRAS途径等在HTFEC-ex19 del细胞中显著富集（图3A-B）。大多数显著上调的致癌基因，如与癌细胞侵袭行为有关的CCL5等在HTFEC-ex19 del组也被富集（图3C）。另外，在HTFEC-ex19 del细胞中，RAS信号通路相关蛋白表达增加、EGFR信号通路受体和配体的整体表达增加（图3D-E）。接下来，我们检查了EGFR下游两条重要的信号通路变化，与GSEA富集分析结果一致的是，与对照组相比，在HTFEC-ex19 del细胞磷酸化AKT的表达显著增强（图3F）。综上，这提示我们EGFR外显子19缺失突变可能是通过PI3K-AKT通路、上皮间质转化途径、p53途径致癌和KRAS来介导细胞的侵袭性行为。

图3 EGFR外显子19缺失后细胞中通过GSEA富集的信号通路A：GSEA富集的信号通路柱状图，横坐标为归一化后的富集分数（NES），纵轴为富集到的信号通路；B：GSEA富集通路图，p53、KRAS途径显著富集；C：GSEA分析差异基因热图，红色为在该组中表达上调，蓝色为表达下调；D，E：RAS，EGF/EGFR信号通路的关键配体和受体的基因表达的Log2FC变化值；F：Western Blot检测磷酸化蛋白水平变化，EGF（20 ng/mL）。Fig.3 GSEA-enriched signaling pathways in EGFR exon 19 deletion cellsA: The histogram of GSEA-enriched signaling pathways. The abscissa is the normalized enrichment fraction (NES). The vertical axis shows the enriched signal pathways; B: The diagram of GSEA enrichment pathway. p53, KRAS pathway significantly enriched;C: Differential gene heat map were analyzed GSEA. Red indicates upregulation in this group, and blue indicates downregulation in this group; D, E: The change of Log2FC value of key ligands and receptors in the RAS and EGF/EGFR signaling pathway; F: The changes of phosphorylated protein levels were detected by Western Blot, EGF (20 ng/mL).

3 讨论

对于甲状腺癌，例如FTC、PDTC或ATC，治疗相对困难[9]，因为通常会发生转移，尤其是ATC发展迅速[11]。因此，了解肿瘤发病的分子机制对靶向治疗甲状腺癌尤为重要。有研究显示，EGFR突变可能是PTC致癌转化的主要遗传改变之一[12]。另一项ATC研究显示，EGFR扩增可能与原发性甲状腺癌的生物学去分化过程有关[13]。本研究中，我们证实了EGFR外显子19缺失突变会导致细胞获得侵袭生长特性，然而对这一现象的机制尚不十分清楚。GSEA富集分析显示在HTFEC-ex19 del细胞中PI3K-AKT、EMT、KRAS、p53等通路的激活。因此，我们考虑EGFR外显子19缺失突变促使细胞发生侵袭性行为，是否与这些通路激活有关，这还有待进一步研究。

我们对HTFEC和HTFEC-ex19 del细胞数据进行GSEA富集分析还发现了几个重要的途径。除了上述结果所述外，我们还发现，EGFR外显子19缺失后细胞具有免疫抑制特征，包括INF γ/α反应、TNFα/NF-κB信号、缺氧和炎症反应。此外，癌症相关信号通路也显著富集，如hedgehog信号通路、糖酵解、有丝分裂纺锤体和活性氧途径（图3A）。这些通路是否也在EGFR外显子19缺失突变促使细胞发生侵袭性行为中发挥重要作用，有待进一步探索。

综上，我们确定了显著改变的通路，这些通路变化可能是EGFR外显子19缺失突变发生侵袭性行为的主要途径。鉴定和表征与这些通路相关的生物学功能，有助于深入了解具有EGFR外显子19缺失突变的恶性甲状腺肿瘤本身的生物学行为。同时，这些基因和通路可以用作潜在治疗靶标或生物标志物，来区别诊断或判断预后情况，为不同的治疗方法组合提供有效选择。