枳术汤治疗脾虚型便秘小鼠有效性实验研究

门唤钊，刘 斌

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.沈阳市肛肠医院，辽宁 沈阳 110002）

慢传输型便秘（STC）又称顽固性便秘，是功能性便秘（FC）最常见的类型。临床上，STC患者有排便时间延长、便质干硬、排便次数减少、排便不畅等症状。脾虚型便秘在临床的表现上，与STC相似。长期便秘，会加重患者的焦虑情绪，形成肛裂、肛乳头增生、肛门狭窄等肛门疾病，同时也会诱发心脑血管疾病，加重患者基础疾病[1-2]。西医治疗便秘通常使用促胃动力药、泻药，这些药物可以短暂地缓解便秘的症状，长期使用会导致肠道内发生病变。中医通常采用汤剂、埋线、针灸、拔罐等方法进行治疗，其副作用小且疗效持久，因此目前临床上通常采用中医药治疗慢性便秘。枳术汤是治疗脾虚型便秘的经典方，现代药理学表明，枳实中含的黄酮类成分以及白术中的石油醚组分和粗糖组分，可以有效地改善脾虚型便秘的症状[3-5]。因此，本实验选用枳术汤治疗脾虚型便秘，为枳术汤治疗脾虚型便秘提供实验理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级小鼠40 只，雌雄各半，(20±2)g，所有小鼠均由辽宁省实验动物质量检测中心进行质量检测。

1.1.2 实验药品及主要试剂：番泻叶500 g购于沈阳维康金天医药有限公司塔湾店；白术60 g和枳实30 g，均购于辽宁中医药大学旁成大方圆药房；麻仁软胶囊购于海王星辰健康药房（柴河街店）。AnticAMP蛋白Kinase Catalytic subunit抗体购于Abcam公司，Anti-PKA beta（catalytic subunit）抗体购于Abcam公司。

1.1.3 实验主要器材：电热恒温鼓风干燥箱、电子秤、显微镜、镊子、眼科剪均由辽宁中医药大学实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及治疗的方法：将40 只SPF小鼠随机分为空白对照组、模型组、枳术汤组、麻仁软胶囊组，每组10 只雌雄各半，经7 d适应性喂养后，对除空白对照组以外的组别，按照邹颖等[6]的方法进行脾虚型便秘模型复制，造模成功后对各组小鼠的粪便含水率进行测量，并给予各组小鼠相应的药物进行治疗。其中，枳术汤组给予临床等剂量的枳术汤进行治疗（即枳术汤在临床上治疗脾虚型便秘患者的每日用量为白术30 g、枳实15 g，共45 g，经换算枳术汤组小鼠的用药量为：45×9.1×25/60 000＝0.17 g，0.17/0.025＝6.8 g·kg-1·d-1）；麻仁软胶囊组给予0.17 g·kg-1·d-1的麻仁软胶囊悬浮液进行治疗；空白对照组及模型组则灌胃等体积的蒸馏水。经过7 d治疗后，检测各组小鼠的粪便含水率，并截取小鼠部分结肠，采用免疫组化的方法检测小鼠结肠中cAMP、PKA蛋白含量的变化。

1.2.2 粪便含水率的检测方法：对各组小鼠粪便含水率进行两次测量，均在早上8:00开始捡取粪便，测出各组小鼠粪便湿重，并按组别放入电热恒温干燥箱内进行干燥，然后测出粪便的干重。依据公式：含水率（%）＝(粪便湿重－粪便干重)/粪便湿重×100%[7]，计算出相应组别的粪便含水率，进行统计分析。

1.2.3 免疫组化的方法：将实验各组小鼠部分结肠取出，将结肠组织进行脱水，石蜡包埋后，进行切片，将结肠组织贴附于载玻片上，烤片机上进行烘烤，随后二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS缓冲液清洗，用柠檬酸盐缓冲液和过氧化氢溶液对抗原进行修复并消除内源性过氧化物酶，并用山羊血清进行封闭。并用一抗、二抗在相应的温度下进行孵育，经过显色、复染、封片后，镜下观察，测定5个随机视野的平均光密度值，并以平均值为该样本中目的蛋白相对表达水平，进行统计分析。

1.2.4 统计方法：本实验所得的所有数据均运用SPSS 26.0统计软件进行统计分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠治疗前后粪便含水率的变化 治疗前模型组、枳术汤组、麻仁软胶囊组小鼠的粪便含水率均低于空白对照组小鼠的粪便含水率（P＜0.01），枳术汤组、麻仁软胶囊组的粪便含水率与模型组小鼠的粪便含水率相似（P＞0.05）。经7 d的药物治疗，与空白对照组相比，模型组、枳术汤组、麻仁软胶囊组均有显著变化（P＜0.01）；枳术汤组及麻仁软胶囊组小鼠的粪便含水率均显著高于模型组小鼠的粪便含水率（P＜0.01），其中枳术汤组小鼠的粪便含水率明显高于麻仁软胶囊组小鼠的粪便含水率（P＜0.01）。经过7 d治疗，枳术汤组小鼠的粪便含水率与治疗前相比有显著增长，麻仁软胶囊组小鼠的粪便含水率与治疗前相比也有小幅度增长，模型组及空白对照组与治疗前相比小鼠的粪便含 水率变化不大。具体情况如表1、图1所示。

表1 治疗前后各组小鼠粪便含水率的变化（±s）

表1 治疗前后各组小鼠粪便含水率的变化（±s）

注：与空白对照组相比，★P＜0.01；与模型组相比，△P＜0.01。

组别 n 治疗前小鼠粪便含水率（%） 治疗后小鼠粪便含水率（%）空白对照组 10 30.93±1.43 30.98±1.51模型组 10 12.57±1.34★ 12.32±1.44★△枳术汤组 10 13.29±0.06★ 17.71±0.99★△麻仁软胶囊组 10 13.55±1.44★ 14.75±0.78★△

图1 治疗前后各组小鼠粪便含水率柱形图

2.2 免疫组化的结果

2.2.1 治疗后各组小鼠结肠中cAMP的蛋白表达：经过7 d药物治疗后，与空白对照组相比，模型组、麻仁软胶囊组、枳术汤组差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，麻仁软胶囊组及枳术汤组小鼠结肠中cAMP的含量均有显著增长（P＜0.01）。枳术汤组小鼠结肠中的cAMP平均OD值，高于麻仁软胶囊组小鼠结肠中cAMP平均OD值，但两者差异无统计学意义（P＞0.05），具体情况如表2、图2所示。各组经免疫组化染色cAMP表达如图3所示。

表2 各组小鼠结肠cAMP阳性表达比较（±s）

表2 各组小鼠结肠cAMP阳性表达比较（±s）

注：与空白对照组相比，★P＜0.01；与模型组相比，△P＜0.01。

组别 n cAMP空白对照组 10 0.34±0.03模型组 10 0.096±0.01★麻仁软胶囊组 10 0.23±0.01★△枳术汤组 10 0.25±0.02★△

图2 各组小鼠结肠cAMP表达水平柱形图

图3 各组小鼠结肠组织中cAMP表达免疫组化照片

2.2.2 治疗后各组小鼠结肠中PKA的蛋白表达：经过7 d药物治疗后，与空白对照组相比，模型组、麻仁软胶囊组、枳术汤组差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，麻仁软胶囊组及枳术汤组小鼠结肠中PKA的含量均有显著增长（P＜0.01）。枳术汤组小鼠结肠中的PKA平均OD值，高于麻仁软胶囊组小鼠结肠中PKA平均OD值，但两者差异无统计学意义（P＞0.05），具体情况如表3、图4所示。各组经免疫组化染色PKA的表达免 疫组织化学照片如图5所示。

表3 各组小鼠结肠PKA阳性表达比较（±s）

表3 各组小鼠结肠PKA阳性表达比较（±s）

注：与空白对照组相比，★P＜0.01；与模型组相比，△P＜0.01。

组别 n PKA空白对照组 10 0.35±0.02模型组 10 0.096±0.01★麻仁软胶囊组 10 0.23±0.02★△枳术汤组 10 0.24±0.01★△

图4 各组小鼠结肠组织中PKA表达柱形图

图5 各组小鼠结肠组织中PKA表达免疫组化照片

3 讨论

便秘是临床上较为常见的一种慢性疾病，而便秘的形成与脾胃的关系十分密切，脾胃气滞、湿邪困脾、胃热肠燥、脾虚血亏等均可导致便秘的发生[8]。中医脾虚型便秘与临床上STC症状相似，且脾虚型便秘小鼠模型造模方便，存活率高[9]。

枳术汤在临床上治疗脾虚型便秘有非常好的效果，全方由枳实和白术两药组成，二药配伍相辅相成有“健脾运脾，行气导滞通便”之功，是治疗便秘的经典名方，目前在临床上被广泛应用。但是其相关的实验机理较少，因此本实验选用枳术汤治疗治疗脾虚型便秘小鼠模型，为枳术汤治疗脾虚型便秘提供一定的实验理论依据。

cAMP-PKA信号通路是参与物质能量代谢的重要细胞传导通路，环腺苷酸（cyclic adenylic acid cAMP）将细胞外的刺激信号，通过细胞内cAMP浓度的变化来影响机体中细胞内信号的转导途径，从而调节蛋白活性、细胞功能和基因表达，影响细胞内各种生理活动[10]。而cAMP的调节作用，需要依靠激活PKA实现。被激活的PKA通过各种细胞内蛋白的磷酸化与cAMP反应元件结合，对机体细胞的基因表达进行调节[11]。本实验的结果显示，脾虚型便秘小鼠的粪便含水率与正常小鼠的粪便含水率相差明显，且结肠中cAMP、PKA的蛋白表达水平均有所下降，在经过7 d的药物治疗后枳术汤组的小鼠的粪便含水率增长明显，且小鼠结肠中cAMP、PKA的蛋白表达水平有明显的增长。说明枳术汤可能是通过上调结肠cAMP-PKA信号通路的含量来增加小鼠粪便含水率，加快肠内蠕动，使粪便排出体外，从而改善便秘的症状。

综上，本实验通过比较枳术汤治疗前后各组粪便含水率的变化，以及各组小鼠结肠中cAMP、PKA蛋白表达含量的变化，验证了枳术汤能有效治疗脾虚型便秘。