人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析

马文君,滕 琳,田顺利,郭校燕,王培培,郑春阳,卫宏远

(1.天津大学,天津 300350; 2.天津强微特生物科技有限公司,天津 300384; 3.天津医科大学总医院保健医疗部,天津 300052)

磷脂是自然界最主要的表面活性剂,因其良好的乳化、分散能力,使其在生物医药、食品、护肤品领域都有广泛应用[1-2]。目前,市场对高纯度磷脂、单一磷脂和稀有磷脂的要求越发迫切。常用改性磷脂是实现上述需求的有效途径。常用改性磷脂的原理是将单个或多个组分从基质中分离出来,在其基础上对天然磷脂的极性头部进行修饰[3]。磷脂的酶法改性具有明显优于物理化学改性的优势,如环境友好,专一性强、效率高等特点[4];磷脂的水解、酯化反应也因多种磷脂酶的选择,使磷脂产物更加丰富多样。

磷脂酶A2(PLA2)是一种水溶性的小分子蛋白质,具有sn-2-酰基水解酶活性,可把磷脂水解生成游离脂肪酸和溶血磷脂。PLA2一般分为三大类,分泌型、胞质型、钙离子非依赖型[5]。磷脂酶A2与脂肪酶的序列具有同源性,具有一些脂肪酶活性[6],陈琼等将PLA2用于部分水解甘油三酯(TAG)制备富甘油二酯(DAG)[7]。PLA2还可用于植物油脱胶,但因其来源少,价格高,大规模应用受到限制[8-9]。此外,PLA2还能放入饲料中增加磷脂利用率,其本身和产物溶血磷脂都可以作为乳化剂应用,作为化妆品成分还具有保湿、促渗透作用,其应用非常广泛。

目前,市场上有部分植物和微生物来源的PLA2具有较高的酶活力[10],但其昂贵的价格限制其在磷脂行业的应用。为了有效地利用PLA2对磷脂进行改性,生产高附加值的磷脂类产品,除了从自然界中筛选和诱变育种等传统方法,可通过分子克隆与基因重组技术将基因进行克隆表达[11],以期实现研究其酶学性质和大规模生产的目标。

人磷脂酶A2不仅可以水解甘油磷脂以产生游离脂肪酸和溶血磷脂[12],还可以催化花生四烯酸从细胞膜磷脂释放,使得人磷脂酶A2在治疗皮肤病(如红斑狼疮、湿疹、牛皮藓等)有显著疗效[13-14]。人磷脂酶A2的原核生物表达,大多呈包涵体表达,本研究通过基因重组技术,可溶表达人源PLA2,并对其进行纯化,旨在以较低成本制备高质量的重组 PLA2,为后期对磷脂进行酶解改性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

大肠杆菌EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21(DE3) 均由本实验室保存;pET28a-MBP质粒 由本实验保存、pET28a-MBP-PLA2由本实验构建;磷脂酶A2Sigma公司;限制性内切酶 NEB公司;胶回收试剂盒 Promega 公司;质粒小提试剂盒 天根生物公司;SDS-PAGE 电泳凝胶试剂盒 强微特生物;高保真PCR聚合酶 强微特生物;实验所用纯化填料 美国GE公司;其他试剂 国产分析纯。

AKTApurifierTM100纯化系统 美国GE公司;SCIE10TI-IID超声波细胞粉碎机 中国宁波新芝;垂直电泳仪 美国Bio-Rad公司;凝胶成像系统 美国UVP公司;GL-21M高速冷冻离心机 中国湘仪公司;UV3100紫外可见光分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人源PLA2基因的克隆及载体构建 根据NCBI上人源PLA2(PLA2G10)基因编码的氨基酸序列信息及催化反应的信息,确定为本实验的目的克隆序列。通过信号肽分析程序对此序列进行信号肽分析,确定目的基因序列。将序列信息提交给通用生物公司,通过密码子优化后,将目的基因片段合成后插入到pET28a+上,得到pET28a-PLA2质粒。通过Snapgene设计麦芽糖结合蛋白(MBP)上下游引物,将MBP作为标签与人PLA2基因融合表达,上游引物P1:GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCatgaa aatcgaagaaggtaaactg;下游引物P2:GGACCCGGCAGC AGCAGCAGCATATTGGATTGGAAGTACAGGTTTTCC TCGATCCCagtctgcgcgtctttcagggc;设计用于扩增pET28a-PLA2骨架的引物,上游引物P3:ATGCTGC TGCTGCTGCCGGGTCC;下游引物P4:CCCGGCAGC AGCAGCAGCATATTGGATTGGAAGTACAGGTTTTCCT CGATCCCTTTTGGAGGATGGTCGCCAC。

首先以P1、P2为引物对,PCR扩增MBP基因片段,再以P3、P4为引物对,PCR扩增pET28a-PLA2骨架,PCR的扩增条件为:98 ℃,3 min;(98 ℃,10 s;65 ℃,30 s;72 ℃,3:30 min)×30 cycles;72 ℃,7 min。将得到的两个片段采用胶回收试剂盒进行片段回收,回收的片段以摩尔比1∶1～1∶10(MBP片段的摩尔数>pET28a-PLA2骨架的摩尔数)于室温采用同源重组的方法进行连接,连接产物转化E.coliDH5α感受态,筛选阳性克隆,并进行测序鉴定[15]。经鉴定的重组表达载体为pET28a-MBP-PLA2,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,用Kan抗性平板进行转化子筛选,正确的克隆于-80 ℃进行保存。

1.2.2 PLA2的诱导表达及条件优化 将-80 ℃保藏的重组表达菌株pET28a-MBP-PLA2-BL21(DE3)复苏后,接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中,37 ℃,100 r/min振荡过夜活化。将活化的pET28a-MBP-PLA2-BL21(DE3)继续扩大培养接种于100 mL含有卡那抗生素的LB液体培养基中,当菌液A600达0.5～0.7时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1～1 mmol/L进行诱导表达。经条件优化确定诱导剂IPTG的加入量及诱导温度为0.5 mmol/L IPTG,16 ℃诱导过夜。6000×g离心10 min收集菌体,超声破菌后(超声功率300 W,超声2 s暂停2 s,超声时间5 min),离心得到菌液上清和沉淀,再用0.5 mmol/L Tris-HCl将沉淀复溶,进行 SDS-PAGE分析,配置10%分离胶和5%浓缩胶,恒定功率10 W电泳45 min[16]。

由于橡胶草悬浮细胞的pH值变化与细胞增殖相关，在缓慢生长期（0～4 d）pH值由6.5迅速下降到5.7左右，悬浮细胞鲜重与干重缓慢增长，此时悬浮细胞的增殖十分缓慢。在对数生长期（4～12 d）保持稳定，基本维持在pH值5.7左右，悬浮细胞鲜重与干重明显呈上升趋势，悬浮细胞迅速增殖。在12 d之后，pH值由5.7上升到6.8，同时，悬浮细胞的鲜重呈缓慢增长，然而悬浮细胞的干重出现缓慢下降的趋势，可能环境不利于悬浮细胞生长。在悬浮细胞生长期间，第12天具有最大干重（图5）。结果表明，悬浮细胞处于不同生理状态时，会使培养液的pH值发生改变，这也是细胞对外界环境所做出的响应。

1.2.3 PLA2的酶活测定 为了初步验证重组蛋白是否正确表达,是否具有水解卵磷脂的活性,本实验采用硼砂卵黄平板对诱导表达后的粗酶液进行初步的酶活定性分析。取50～200 μL浓缩10倍的细胞破碎上清加入硼砂卵黄平板上的牛津杯中,37 ℃温育12～24 h,观察透明水解圈的产生情况来验证重组蛋白有无活性,并根据水解圈的大小初步确定重组酶酶活的大小[17]。

1.2.4 PLA2的纯化 将诱导后收集的pET28a-MBP-PLA2-BL21(DE3),均匀悬浮于50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液中,经超声破菌后,20000×g离心,收集上清,经0.45 μm滤膜过滤后,首先采用Q柱纯化,经Q-A buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA,5%甘油)洗涤后,采用Q-B buffer(20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,5%甘油,1 mol/L NaCl)进行洗脱,收集洗脱组分。洗脱组分经硫酸铵沉淀、离心后,采用疏水柱Phenyl进行纯化。采用Phenyl-A buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5,1.5 mol/L硫酸铵)进行洗涤、平衡,采用Phenyl-B buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5)进行洗脱。收集洗脱组分,采用Amylose亲和柱进行纯化。采用Amylose-A(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4,1 mmol/L EDTA,0.2 mol/L NaCl)进行洗涤、平衡,采用Amylose-B(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4,1 mmol/L EDTA,0.2 mol/L NaCl,10 mmol/L 麦芽糖)进行洗脱,收集洗脱组分,进行10% SDS-PAGE分析,具体方法参照1.2.2。

1.2.5 酶活分析 磷脂酶A2的酶活分析采用酸碱滴定法[18]:称取一定量的卵磷脂,用50 mmol/L Tris-HCl pH8. 0进行溶解,再加入10 g/L的Triton X-100 制成反应底物,4 ℃冰箱避光保存备用。分别加入9 mL的底物,20 μL 50 mmol/L的CaCl2溶液,另一组加入15 mL的乙醇作为对照,最后加入1 mL粗酶液,40 ℃反应15 min,用一定浓度的NaOH滴定,通过计算消耗NaOH的量来得到磷脂酶A2的酶活。1 min解磷脂生成1 μmoL脂肪酸所需的磷脂酶A2的量定义为1 U,总蛋白含量测定方法参照牛血清白蛋白(BSA)蛋白浓度测定试剂盒说明书,结合总蛋白和总活力计算相应比活力,得率和纯化倍数,计算公式如下:

1.2.5.1 pH对重组酶活性和稳定性的影响 将纯化得到的磷脂酶A2(10 μL)在50 ℃下预孵育30 min,以含有卵磷脂的反应混合物为底物,以40 μL不同pH缓冲液(100 mmol/L乙酸盐(pH4.0、5.0和6.0)、50 mmol/L三氯化甘油(pH7.0、8.0和9.0)、50 mmol/L甘氨酸pH10.0和11.0)和8 mmol/L CaCl2作为缓冲液进行反应[19]。

1.2.5.3 金属离子对重组酶活性影响 将20 mmol/L 50 μL的重组酶添加到含有底物(卵磷脂)和30 mmol/L 100 μL不同金属离子(Ca2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Na+、K+和Mn2+)的溶液中后测量活性。另外,以Triton X-100溶液为缓冲液进行对照。通过将不同因素的酶活性除以对照组的100%,计算出重组酶的相对活性(%)[20]。

1.2.5.4 重组酶的底物特异性和动力学特性分析 为研究重组磷脂酶A2对于不同甘油磷脂的底物特异性,将不同的底物磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和二磷脂酰甘油(DPG)加入含有20 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)中作为底物[21]。用纯化的重组磷脂酶A2(10 μL)于40 ℃下进行反应,并将底物浓度从0.5 mg/mL增加到5.0 mg/mL。分别以1/[S]和1/V0为横坐标和纵坐标,通过使用Lineweaver-Burk图测定选定底物的Vmax和Km值,研究重组酶A2对不同甘油磷脂的特异性和亲和力。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复3次,采用SPSS 22.0软件进行数据显著性分析,应用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 人源PLA2基因的克隆与载体构建和表达

根据信号肽分析显示,人PLA2(PLA2G10)前31个氨基酸为信号肽序列,因此本实验化学合成了PLA2自32位氨基酸之后的序列作为本实验研究对象。通过同源重组将MBP促溶标签片段与PLA2基因片段共同构建于pET28a载体上,构建载体pET28a-MBP-PLA2,构建载体如图1所示,使目的蛋白与MBP融合表达。通过采用T7/T7t引物对,对构建的载体进行PCR验证表明,如图2,获得1500 bp左右的目的条带与1101 bp的MBP基因和438 bp的PLA2基因相加之和相吻合。并通过进一步测序验证,证实目的载体构建成功。经IPTG(最佳添加量为0.5 mmol/L)在低温诱导过夜后,重组融合蛋白(～60 kDa)在上清中大量表达(如图3)。同时,观察硼砂卵黄平板上透明圈(如图4),阴性对照即没有添加磷脂酶的缓冲溶液并没有形成明显的水解透明圈,样品组与阳性对照sigma的磷脂酶PLA2均形成明显透明圈,说明目的蛋白得到正确表达。

图1 表达载体pET28a-MBP-PLA2构建Fig.1 Construction of expression vector pET28a-MBP-PLA2

图2 pET28a+-MBP-PLA2重组载体的PCR验证结果Fig.2 Identification of PCR product注:1,2都为PCR产物。

图3 表达产物的 10% SDS-PAGE 鉴定Fig.3 SDS-PAGE(10%)profile of expressed recombinant protein注:1:诱导前全菌;2:诱导后全菌; 3:诱导后上清;4:诱导后沉淀。

图4 卵黄平板法检测粗酶活性Fig.4 Activity determination of phospholipase activity of PLA2注:0号阴性对照为加入200 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)溶液,1号阳性对照为加入200 μL Sigma 磷脂酶A2,2～5号样品组分别为加入 200、150、100和50 μL浓缩10倍的细胞破碎上清。

本实验中重组磷脂酶A2单独表达呈包涵体状,尝试了其余多种促溶标签融合表达,包括Sumo、GST、MBP等,但经IPTG 诱导后,Sumo、GST促溶标签蛋白并不能使重组蛋白PLA2可溶表达,而仅以MBP为促溶标签的融合蛋白是可溶性表达的。MBP是一种大肠杆菌的内源性的蛋白质,由大肠杆菌K12的malE基因编码,分子量为42 kDa,在大肠杆茵中具有极高的表达量。在目的蛋白的氨基端添加该标签蛋白时,可大幅度地提高目的蛋白的可溶性表达量,并且可帮助目的蛋白在大肠杆菌中正确折叠并保持原有的活性[22]。

表1 Recombinant-PLA2酶活和纯化回收率分析Table 1 Analysis of enzyme activity and recovery rate for rhMBP-PLA2 purification

2.2 重组磷脂酶A2的分离纯化

为了获得纯度较高的重组磷脂酶A2,本实验建立了如1.2.4方法所描述的纯化步骤,经超声破碎的细胞上清液,依次经过Q柱、疏水Phenyl柱、Amylose亲和层析柱,最终获得一条介于45.0～66.2 kDa之间的条带(如图5C),与预期的重组蛋白56.5 kDa大小相符,其纯度达到90%以上,并测得纯化后的融合磷脂酶A2比活力为127.04 U/mg(表1),纯化倍数10.3,最终回收率约为48.8%。1 L重组菌培养后,经本实验的表达、纯化步骤,可得到约3.07 mg高纯度的重组融合磷脂酶A2。

微生物来源的PLA2国内外研究都比较少,导致PLA2酶价格昂贵,无法实现工业化。卢冬梅等[23]对 Aeropyrum pernix K1 的磷脂酶 A2基因在大肠杆菌中进行了表达,蛋白纯化后,以对硝基苯酚丙酸酯为底物测得的酶活为115 U/mg。刘爱霞等[24]利用红色链霉菌PLA2基因构建重组菌,以本实验定义酶活单位计算酶活为133 U/mg左右。本实验获得的重组酶比活力为127.04 U/mg,与之前报道的结果具有一致性。本实验建立了稳定的重组融合蛋白的纯化条件:在Q柱纯化过程中,经测试20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,5%甘油,1 mol/L NaCl的缓冲液体系更适合维持融合蛋白的溶解度和稳定性;硫酸铵达到50%～60%饱和度后,沉淀蛋白回收效率最高;此外,实验还通过TEV蛋白酶将重组融合PLA2蛋白的MBP标签切割下来,进行了酶活性分析,结果表明重组融合蛋白的活性与PLA2蛋白活性相似,鉴于采用TEV酶切割,再经过去TEV酶的纯化过程造成的损失,本实验进行酶活反应采用重组融合蛋白进行(下同)。

图5 重组融合磷脂酶A2蛋白的纯化曲线Fig.5 Purification curves of recombinant PLA2注:(A-1,A-2)Q-琼脂糖凝胶离子交换层析,(B-1,B-2)疏水层析结合Q离子交换层析(C-1,C-2)MBP融合蛋白的Amylose亲和层析结合Q离子交换层析和疏水层析红色虚框为目标蛋白。

图6 重组磷脂酶A2最适pH(A)最适温度(B)及不同金属离子(C)对酶活的影响Fig.6 Effects of pH,temperature and metal ions on the catalytic activity of rhMBP-PLA2注:a,b,c,d,e代表不同pH和离子间差异显著性。

2.3 重组磷脂酶A2的酶学性质分析

pH、温度、金属离子对纯化后的重组磷脂酶A2酶活的影响,结果见图6。由图6A可知,在40 ℃下,重组磷脂酶A2的酶活随着反应pH呈现先上升后下降的趋势,在7.0～8.0时,相对活性维持在90%～95%,因此确定该酶最适反应pH为8.0左右。

从图6B可知,重组磷脂酶A2在pH为8.0时,酶的最适温度为40 ℃。温度达到60 ℃仍保留50%的酶活力,在已报道的微生物来源的PLA2中,反应最适温度相对较高,一般为50 ℃甚至更高。

机体内大约30%的酶发挥其生物活性均需要各种各样金属离子的参与,特别地,有一部分金属如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+等是人体正常新陈代谢所必需。重组磷脂酶A2依赖于金属离子发挥功能。金属离子不仅作为酶的激活剂,有些离子对酶还会起到抑制作用,由图6C可知,不同金属离子显著影响重组酶的活性,尤其是加入30 mmol/L钙离子,重组酶活性最高,这与重组酶有Ca2+的结合位点有关,与相关文献的研究结果一致[25]。而Co2+与Cu2+则对重组磷脂酶A2起到显著抑制作用,主要是由于重金属使得蛋白质结构发生改变,磷脂酶活性下降[26]。

通过研究酶与底物的亲和力,本实验测定了重组酶对不同酯基的酶解动力学参数,由表2可知重组磷脂酶A2对PC(卵磷脂)的亲和力最高,Km值最小。此外,这一结果还说明重组磷脂酶A2对不同的甘油磷脂具有不同的特异性和水解活性,这一研究结果与Liu等[27]研究吻合,从而进一步证实了本实验结论的可靠性。

表2 重组磷脂酶A2的底物亲和性质Table 2 Substrate selectivity of rhMBP-PLA2

3 结论

本研究所构建的重组菌可实现人源磷脂酶A2的异源可溶表达,通过建立稳定的纯化工艺,最终重组磷脂酶A2得到了高质量的纯化,最终得到的重组酶纯度大于90%,酶活为127.04 U/mg,纯化倍数为10.3,活性回收率为48.8%。测得重组磷脂酶A2的最适温度为40 ℃,最适pH为8.0。本试验建立的磷脂酶A2的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。