青鳉脑型芳香化酶cyp19b基因的敲除和鉴定

常宇阳，武小雯，郭海燕, 关桂君

(1.上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;2.上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306;3.上海海洋大学 水产科学国家实验教学示范中心, 上海 201306)

芳香化酶(Aromatase)是内源性雌激素合成的关键酶[1]。哺乳类和鸟类中，芳香化酶由一个单拷贝的cyp19基因所编码[2]，在鱼类中则存在两种不同的芳香化酶编码基因cyp19a和cyp19b。青鳉(Japanese medaka HdrR，Oryziaslatipes)胚胎发育时期，雌雄鱼脑部cyp19b的表达没有明显差别，随着青春期性成熟过程开始，cyp19b表达开始出现雌雄性差，脑中cyp19b表达量雌性高于雄性，提示cyp19b可能参与脑-性腺轴的雌雄性分化调控[3]。除了在脑中表达，cyp19b在鱼类的性腺、肝脏等器官中也有表达[4]。cyp19a主要在卵巢中表达，是雌激素合成关键酶，以维持卵巢和卵母细胞发育。化学诱导突变(ENU-based mutagenesis)青鳉cyp19a研究显示，cyp19a缺失突变个体有早期卵巢发育，但在青春期之后因部分卵巢退化而出现卵巢向精巢转化的XX雄性逆转表型。并且cyp19a和cyp19b双突变个体表型同cyp19a单独敲除的表型基本一致，证明内源性雌激素不是XX生殖细胞进入卵细胞早期发育的必需因子[5]。由于青鳉cyp19b的功能未知，我们利用CRISPR/Cas9系统设计了靶向敲除cyp19b，成功建立了可遗传的cyp19b缺失品系。

青鳉与人类一样拥有XY型性别决定系统[6]，这使得青鳉成为研究性别调控和性别分化的良好模式动物。其繁殖快，世代周期短，每天都能产卵，并且胚胎透明，能方便地进行显微注射操作。近年来CRISPR/Cas9系统由于操作简便、效率高，在青鳉基因编辑中已经有不少成功的应用[7-8]。研究使用CRISPR/Cas9系统，通过直接注射gRNA和Cas9蛋白进行基因编辑，免去了质粒构建等步骤，简化了实验流程[9-11]。青鳉cyp19b基因敲除品系的建立，将为研究芳香化酶在性腺性别分化中的作用提供了实验素材。

1 材料与方法

1.1 实验动物及养殖条件

采用的青鳉为HdrR品系，饲养在26 ℃～28 ℃的循环水箱系统中，光暗循环时间为14/10 h。实验涉及的所有动物实验，都遵照上海海洋大学动物实验委员会的规定严格执行。

1.2 基因敲除靶位点设计

1.2.1 序列比对分析保守结构域

设计靶点前，首先要对目的基因编码的蛋白质进行保守结构域的分析。使用ensemble(http://www.ensembl.org)网站检索和下载人(Homosapiens，Hum)、鸡(Gallusgallus,Chk)、青鳉(Oryziaslatipes，Ola)、罗非鱼(Oreochromisniloticus，Ore)的Cyp19b蛋白序列，采用 Vector NTI11.5进行氨基酸同源性序列比对分析，并根据Pfam数据库(http://pfam.xfam.org)，将蛋白质氨基酸序列同源保守的结构域进行标注。

1.2.2 在保守结构域上设计靶位点

通过crisprscan(https://www.crisprscan.org/)网站[12]，分别在青鳉cyp19b基因的第2和第4外显子上检索预测CRISPR/Cas9编辑系统的靶向敲除位点，选择评分高且不易产生脱靶效应的2个靶点进行引物设计。在选定的靶序列5′端加上T7启动子序列，3′端加上能通过PCR与gRNA scaffold相连的序列(表1中下划线显示)，最终合成的序列为cyp19bgRNA1和cyp19bgRNA2(表1)。还要合成一段gRNA-scaffold序列,合成的序列如表1所示。上述寡聚核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成并提供。

表1 用于gRNA合成的DNA片段

1.3 gRNA的制备

将cyp19bgRNA1和cyp19bgRNA2分别通过PCR与SgRNA-scaffold 相连。PCR反应程序为94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性 30 s，65 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，34个循环；72 ℃ 再延伸5 min。PCR的产物通过QIAquick PCR Purification Kit试剂盒(QIAGEN,28104)进行纯化，之后通过MAXIscript T7 In Vitro Transcription Kit(Thermo Fisher，AM1312)试剂盒进行体外转录，得到gRNA1和gRNA2。通过氯化锂(LiCl)沉淀法纯化RNA(向体外转录得到的gRNA中加入1/10体积的4 mol/L LiCl和2.5倍体积的无水乙醇，放置在-80 ℃冰箱1 h，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，吸弃上清液，再用70%乙醇清洗沉淀。移除乙醇，等离心管内残留的乙醇挥发后，用20 μL无酶水溶解沉淀，即得到纯化后的gRNA)。纯化完成放入-80 ℃冰箱备用。

1.4 显微注射

显微注射液的组成：gRNA1和gRNA2浓度均为100 ng/mL，Cas9蛋白(金斯瑞GeneScript,Z03385-100)150 ng/mL。注射前一天，用隔离缸将青鳉的雄性与雌性隔离，注射当天解除隔离，使之交配并收取受精卵。青鳉自然交配受精后，卵细胞被激活进入减数分裂II期分裂相，并释放极体。单倍体精子和卵子的细胞核融合最终形成合子，细胞质由植物极向动物极进行迁移。大约在30 min后抵达动物极，显微镜下观察到半透明凹陷状单一细胞。用毛细管显微注射针，将配制的gRNA和Cas9蛋白混合液，注入此单一细胞内。

1.5 突变鉴定及纯合子选育

将注射后的胚胎养至性成熟，剪尾鳍用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP324-03)提取基因组DNA，再用引物Fw9和Rv10(表1)进行基因组DNA的PCR扩增。PCR产物用T7E1(金斯瑞GeneScript, Z03396-250)酶切，能切开的即为突变体F0代。将F0代突变体，与相对应的雌或雄性野生型青鳉进行配对交配(外交)。将子代养至成鱼，再提取DNA，用Fw5和Rv6引物PCR。PCR产物进行TA克隆并送测质粒，得到F1代杂合子突变型。将确认的F1代具有相同突变型的杂合子雌雄个体进行配对杂交，最终得到F2代cyp19b基因敲除的纯合子青鳉。

2 结果与分析

2.1 cyp19基因不同物种间的进化保守性

青鳉cyp19b基因编码499个氨基酸，并且含有一个细胞色素P450同工酶特有同源结构域，这一结构域的氨基酸序列从鱼类到人Cyp19蛋白中都保守存在，是蛋白酶催化活性必不可缺的(图 1)。由于这一结构域在Cyp19a和Cyp19b中都存在，在设计靶位点时，既要保证破坏Cyp19b中P450功能结构域，又要避开因为P450结构域相似度高而破坏Cyp19a功能的靶点。

图1 不同物种的Cyp19氨基酸序列同源比对

2.2 cyp19b基因敲除青鳉的筛选和鉴定

设计的基因敲除双靶位点如图2(a)所示。取5条显微注射后的成鱼尾鳍DNA，用Fw9和Rv10引物进行基因组PCR扩增，PCR产物进行T7E1酶切消化，其结果显示为野生型(WT)未能被T7E1酶切消化，因而呈一条带，如图2(b)WT所示。#1、#2、#3、#5同WT一样，不能被T7E1酶切消化；而#4个体，因其DNA双链错配而被T7E1酶切消化，酶切反应呈阳性，出现WT以外的两条带。这条F0突变体是雄鱼，我们将其与3条野生型的雌鱼进行配对，并将其产生的子代养大。

(a)青鳉cyp19b基因敲除策略示意图；(b)F0代青鳉突变体的筛选鉴定电泳图(T7E1酶切)

2.3 cyp19b基因敲除F1代青鳉的鉴定

针对F0代突变型种鱼与正常青鳉杂交得到的子代青鳉，取尾鳍DNA进行靶点区域的基因组鉴定，分离得到两种可遗传的突变类型[图3(b)]。第1种是因双靶点的有效切割，导致562 bp的缺失，并同时插入9 bp碱基的突变体，我们将其命名为Mut1。Mut1型突变的杂合子用引物Fw5和Rv6进行PCR能够扩增得到两条带，没有突变的条带是920 bp，发生突变的条带是367 bp[图 3(b)]。第2种是在第1个靶位点缺失了5 bp，在第2个靶位点插入了10 bp，命名为Mut2。在Mut2的特异序列位点附近，设计了一对特异性引物Fw13和Rv14(表1)，这对引物能够有效和特异性扩增Mut2突变类型的杂合子或者纯合子，得到长度为579 bp的PCR产物，而野生型则无PCR扩增条带[图 3(a)]。虽然特异性引物Fw13和Rv14能鉴别野生型和Mut2突变型，但无法区分杂合子和纯合子突变，还要利用Fw5和Rv6引物对其进行基因组PCR扩增和DNA测序来最终确认Mut2的杂合子或纯合子。DNA测序的峰图显示，靶位点处有重叠峰的为杂合子，靶位点处呈现单峰，并且序列不同于野生型的为纯合子[图3(c)]。

突变体氨基酸序列显示，Mut2因缺失5个碱基产生移码突变和终止密码子的提前出现，形成缺失P450功能结构域的蛋白产物，导致Cyp19b功能丧失[图 3(d)]。Mut1突变体虽发生大片段缺失，但没有发生移码突变，最终导致在保守的P450结构域上丢失130个氨基酸，推测Mut1型突变体的蛋白酶活性功能也会部分或完全受损。

(a)野生型和两种突变型的DNA序列；(b)两种突变型的电泳鉴定；(c)两种突变型的DNA测序峰图；(d)野生型和两种突变型(完全或部分缺失P450结构域)对应的氨基酸序列

2.4 青鳉Cyp19b敲除型纯合子的筛选及其表型观察分析

将具有相同突变基因型的cyp19b+/-的性成熟青鳉雌雄配对，产生的子代3个月性成熟后剪取尾鳍，将抽提得到的基因组DNA为模板，用特异引物进行PCR及测序鉴定，筛选得到纯合子。初步观察显示，cyp19b-/-纯合子没有发生明显的胚胎期死亡，基本上都能够正常发育至成鱼。性成熟的cyp19b-/-纯合子青鳉有雄性也有雌性，目前鉴定得到Mut1纯合子7条雄鱼和5条雌鱼，Mut2纯合子5条雄鱼和4条雌鱼。两种突变类型的纯合子均可正常交配繁殖子代，说明cyp19b基因不是胚胎发生发育必不可少的因子。

3 讨论

研究在青鳉中首先实施了用PCR直接扩增gRNA模板的简易CRISPR/Cas9方法敲除cyp19b基因，并成功筛选出两种突变纯合子(cyp19b-/-Mut1 & Mut2)。相比单靶点敲除，双靶点可在不同位点同时进行敲除而产生靶基因的大片段缺失，既提升敲除概率，又能确保靶向基因功能区域的彻底敲除，还有利于突变型的PCR筛选。但是多靶点同时敲除，也意味着脱靶效应风险的增加[13]。为了避免基因编辑过程中产生脱靶，应该选择潜在脱靶效应少的靶位点，用gRNA和Cas9蛋白质的最佳匹配浓度实施显微注射，最大限度地降低脱靶效应发生[14]。实验得到的两个不同类型的突变，全部或部分破坏了cyp19b基因的细胞色素氧化酶P450结构域[15-16]，从而破坏了Cyp19b蛋白产物的生物学活性。初步观察发现cyp19b突变型纯合子雌雄个体均能够正常生长繁殖。斑马鱼中敲除cyp19b基因显示其精巢和卵巢发育正常，也能够正常繁殖[17]。然而，有报道发现cyp19b基因敲除的罗非鱼雄性精巢，其输精管发育异常而形成输精管阻塞纤维化，导致雄性不育[18]，提示罗非鱼和小型鱼类(青鳉和斑马鱼)的cyp19b基因在精巢发育中的功能多样性。鱼类的性别决定既有遗传决定的XY型或ZW型，也有温度、光照或pH等非遗传决定因素。鱼类和其他脊椎动物的性别决定因素虽呈多样性，但调控生殖细胞进入雌雄分化的信号通路仍有高度的进化保守性。最新研究发现Elavl2和Ddx6是调控小鼠卵泡休眠期进入活跃期转变的关键因子[19-20]，在gsdf缺失卵巢中也显著升高，提示Elavl2和Ddx6可能受gsdf调控，参与调控卵泡休眠期进入活跃期的转变过程。我们还发现gsdf和cyp19b双敲的XY性腺中，卵母细胞数目显著下降，提示cyp19b可能同Elavl2和Ddx6，或其他未知因子协同参与生殖干细胞微环境的调控。

青鳉cyp19a和cyp19b在性分化过程中的表达部位不同，在发育过程中的时空表达不重叠，推测两者功能互补的可能性不高[21]。cyp19a和cyp19b双敲结果[5]和本实验cyp19b单独敲除之后的结果，都说明青鳉cyp19b对性腺分化和发育的影响是有限的，其他因子可能替代cyp19b参与调控生殖细胞性分化的作用。Cyp19b敲除品系为进一步研究其功能以及其他因子的遗传补偿作用，提供了活体研究平台。

实验首次采用改良的简易CRISPR/Cas9 系统对青鳉cyp19b基因进行敲除，成功得到了两个不同突变类型的cyp19b敲除青鳉。cyp19b敲除青鳉模型的成功构建为研究脑型芳香化酶在青鳉脑和性腺性别分化中的作用打下了坚实的基础。