大孔树脂纯化甜茶多酚及其对 α-葡萄糖苷酶抑制活性和DPPH·抗氧化性的研究

吴婕, 宫江宁

(1.贵州师范学院化学与材料学院, 贵阳 550018; 2.贵州师范大学化学与材料科学学院, 贵阳 550001)

近年来，人工合成药物的不安全性逐渐被人们认识，寻求无毒副作用的降血糖和抗自由基氧化的药食同源植物是食品和医药界研究的热点问题。甜茶(RubussuavissimusS. Lee)是药食同源植物[1]，也是我国重要的农业经济型作物。甜茶属于蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(RubusL.)植物。甜茶富含氨基酸、微量元素、黄酮类化合物和多酚类化合物等[2]，具有降血糖[3-4]、抗氧化[5]、抗癌和降血压[6]的药理功能。

目前，甜茶的降血糖和抗氧化作用机制在细胞[7-8]、动物[9-11]和临床[12]等实验中得到了进一步明晰，但尚未见有关不同溶剂萃取大孔树脂纯化的甜茶多酚对 α-葡萄糖苷酶活性和DPPH·自由基的研究。本研究根据大孔树脂对甜茶多酚的静态和动态的吸附-解吸性能试验，优化出HPD-826树脂分离纯化甜茶多酚的工艺参数；分析了HPD-826树脂纯化甜茶多酚以及其萃取物抑制α-葡萄糖苷酶活性和清除DPPH·自由基的效果，找出适合开发成为ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂和抗自由基氧化的抗氧化剂的萃取相，为提高农产品甜茶的经济价值贡献理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甜茶，购于贵州省健康茶科技有限公司；没食子酸标准品，购于百伦斯生物技术公司；HPD-826树脂，购于郑州和成新材料科技有限公司；LSA-21树脂，购于和成新材料工厂；D101树脂和AB-8树脂，购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司。α-葡糖糖苷酶(α-glucosidases)，Sigma-Aldrich Company生产；4-硝基苯酚-α-D 吡喃葡萄糖苷(PNPG), Sigma-Aldrich Company生产；无水乙醇、氢氧化钠和盐酸等均为分析纯。

UV-2300紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司生产；KL04A型离心机，湖南凯达公司生产；JL2002型电子天平，淮安金良电子科技有限公司生产。

1.2 大孔树脂的活化处理

将4种大孔树脂(HPD-826、LSA-21、D101、AB-8)在5% NaOH溶液中浸泡4 h，洗去碱溶性杂质至中性；在5% HCl溶液中浸泡4 h，洗去酸溶性杂质至中性；用无水乙醇浸泡4 h，洗去醇溶性杂质。大孔树脂活化后备用。

1.3 大孔树脂的筛选

向活化好的4种2.0 g树脂中加入甜茶多酚粗制溶液(100 mL，0.62 mg·mL-1)，振荡吸附24 h，测定大孔树脂静态吸附后的甜茶多酚质量浓度。用100 mL无水乙醇对吸附饱和的大孔树脂振荡解吸24 h，测定大孔树脂静态解吸后的甜茶多酚质量浓度。

本研究中大孔树脂静态吸附-解吸试验均重复3次，结果取平均值，计算公式如下。

吸附量A=(CⅠ-CⅡ)×VⅠ/MⅠ

(1)

吸附率B=(CⅠ-CⅡ)×100/CⅠ

(2)

解吸率C=CⅢ×VⅡ×100/(CⅠ-CⅡ)×VⅠ

(3)

纯度D=CⅢ×VⅡ×100/MⅡ

(4)

式中,A为大孔树脂对甜茶多酚的吸附量，mg·g-1；B为大孔树脂对甜茶多酚的吸附率，%；C为大孔树脂对甜茶多酚的解吸率，%；D为甜茶多酚纯度，%；CⅠ、CⅡ、CⅢ分别为初始、吸附后和解吸出的甜茶多酚质量浓度，mg·mL-1；VⅠ、VⅡ分别为粗制样品体积和洗脱剂乙醇体积，mL；MⅠ为大孔树脂的质量，mg；MⅡ为经过大孔树脂纯化后甜茶的质量，mg。

1.4 HPD-826树脂动态吸附-解吸甜茶多酚的研究

将20 mL活化的HPD-826树脂装入层析柱中，分析上样液的质量浓度、体积和上样流速对HPD-826树脂吸附率的影响；探讨洗脱剂乙醇的体积分数、洗脱体积和洗脱流速对HPD-826树脂解吸率的影响。找到HPD-826树脂纯化甜茶多酚的最佳工艺条件。

1.4.1上样液质量浓度的优化 分别将100 mL上样液(质量浓度1.0、2.0、3.0和4.0 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速加入HPD-826树脂柱中，测定流出液中甜茶多酚质量浓度，得到HPD-826树脂的吸附率。

1.4.2上样流速和上样体积数的优化 将上样液(100 mL，2.0 mg·mL-1)以不同上样流速(2和3 BV·h-1)加入到HPD-826树脂柱中，测定流出液甜茶多酚的质量浓度，得到适宜的上样流速和上样体积数。

1.4.3洗脱液乙醇体积分数的优化 分别将250 mL不同体积分数(30%、40%、50%、60%和70%)乙醇洗脱液，以2 BV·h-1流速，洗脱饱和HPD-826树脂柱，测定流出液甜茶多酚的质量浓度，得出HPD-826树脂的解吸率。

1.5 α-葡萄糖苷酶抑制剂反应体系的筛选

以降低餐后血糖的常见口服降血糖药阿卡波糖为参照[13-14]，将HPD-826树脂纯化样品浓缩，分别用乙酸乙酯和三氯甲烷进行萃取，得到乙酸乙酯相萃取物和三氯甲烷相萃取物，测定其α-葡萄糖苷酶抑制率。

参照吴婕等[14]的方法，将α-葡萄糖苷酶(0.2 mL，0.5 U·mL-1)加入到0.2 mL 样液中，放置在恒温(37 ℃)水浴锅中反应(15 min)，在反应混合溶液中加入PNPG(0.1 mL，5 mmoL·L-1) ，继续反应 20 min；加入Na2CO3溶液(1.4 L，0.2 moL·L-1)；磷酸钾缓冲溶液(0.1 mmoL·L-1，pH 6.8)定容10 mL。平行试验3 次，在402 nm处测定硝基苯的吸光度值，结果取平均值。抑制率计算公式如下。

抑制率Q=[Q空白-(Q样品-Q背景)]×100%/Q空白

(5)

式中，Q为甜茶多酚对α-葡萄糖苷酶抑制率；Q样品为待测体系的吸光度；Q空白为不加样液体系的吸光度；Q背景为不加酶体系的吸光度。

1.6 甜茶多酚抗氧化性研究

配制成不同质量浓度的甜茶多酚样品，以常见的抗氧化剂Vc为参比，测其吸光度，计算DPPH·清除率。参照崔紫姣[15]的方法，以乙醇(分析纯)作为参比，将甜茶多酚样品放置于暗处30 min，在515 nm处，测其吸光度。加入DPPH·溶液(1.6 mL，0.2 mg·mL-1)，测定吸光度(Z0)；移取1.0 mL甜茶多酚样品，测定吸光度(Z1)；测定混合液(1.0 mL甜茶多酚样品+1.6 mL DPPH·溶液)的吸光度(Z2)。DPPH·清除率(Z)的计算公式如下。

DPPH·清除率Z=[1+(Z1-Z2)/Z0]×100%

(6)

1.7 数据处理

采用SPSS 22.0对数据进行分析，利用LSD法进行多重比较。采用Origin 11.0制图。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂吸附-解吸甜茶多酚的效果

由表1可知，不同型号大孔树脂对甜茶多酚吸附-解吸能力差异较大，由于HPD-826树脂对甜茶多酚的吸附是通过氢键作用，具有最高的平均吸附率(28.1%) 和平均解吸率(99.5%)，故HPD-826树脂最适合用于纯化甜茶多酚。

表1 4种大孔树脂的静态吸附-解吸结果Table 1 Static adsorption and desorption capacity results of four macroporous resins

2.2 HPD-826树脂动态吸附-解吸甜茶多酚的优化工艺条件

2.2.1上样液质量浓度 由图1可知，随着上样液质量浓度增加，HPD-826树脂对甜茶多酚的吸附率表现出先增加后减小的趋势。当上样液质量浓度为2.0 mg·mL-1时， HPD-826树脂对甜茶多酚的平均吸附率最大(92.9%)，因此，最佳上样液质量浓度为2.0 mg·mL-1。

图1 上样液质量浓度对吸附率的影响Fig.1 Effect of sample mass concentration on the adsorption rate

2.2.2上样流速 当大孔树脂吸收后的流出液质量浓度为上样液质量浓度的10%时，即达到大孔树脂渗漏点[16]。如图2所示，当上样流速为2和3 BV·h-1时，HPD-826树脂的渗漏点对应的累计上样体积分别在60和50 mL。综合考虑，应选择50 mL上样液和2 BV·h-1流速为宜。

图2 上样流速对吸附效果的影响Fig.2 Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency

2.2.3洗脱液乙醇体积分数 图3显示，洗脱液体积分数从30%增加到70%时，HPD-826树脂对甜茶多酚的解吸率有先增大后减小的趋势。当洗脱液乙醇体积分数为60%时，HPD-826树脂对甜茶多酚的解吸率达到最大值73.1%。因此，本研究中洗脱剂乙醇的最佳体积分数为60%。

图3 乙醇体积分数对解吸率的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on desorption rate

2.3 不同极性溶剂萃取物对ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率

ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制人体ɑ-葡萄糖苷酶的活性，降低餐后血糖值[14]。如图4 所示，甜茶多酚在一定质量浓度范围内，其不同极性溶剂萃取物与 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率呈现出正相关关系(R2=0.92～0.98)。若甜茶多酚质量浓度相同时，其不同极性溶剂萃取物对 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率差异较大，其强弱顺序依次是：乙酸乙酯相萃取物 > HPD-826树脂纯化样品 > 阿卡波糖 > 粗制样品 > 三氯甲烷相萃取物。乙酸乙酯相萃取物、HPD-826树脂纯化样品、阿卡波糖、粗制样品、三氯甲烷相萃取物分别对 ɑ-葡萄糖苷酶抑制作用的半数抑制浓度(IC50)值分别为0.183、1.328、0.379、2.109和79.676 mg·mL-1。由此可见，乙酸乙酯相萃取物和HPD-826树脂纯化样品对ɑ-葡萄糖苷酶的活性抑制率均优于参照物阿卡波糖，其中乙酸乙酯相萃取物最适合开发成为医药ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂。

图4 不同极性溶剂萃取物对 α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.4 Inhibition rate of α-glucosidase by different polarity solvent extracts

2.4 甜茶多酚对DPPH·的抗氧化性

图5结果表明，在一定质量浓度范围内，粗制样品、三氯甲烷相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、参照物Vc与HPD-826树脂纯化样品具有抗氧化性，均能有效的清除DPPH·。乙酸乙酯相萃取物、参照物Vc、HPD-826树脂纯化样品、粗制样品和三氯甲烷相萃取物对DPPH·的半数抑制浓度IC50值分别为0.060、0.385、0.553、0.729和0.868 mg·mL-1。由此可见，乙酸乙酯相萃取物对DPPH·抗氧化效果最好，适合开发成抗氧化剂。

图5 不同样品的DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of different samples

3 讨论

3.1 甜茶多酚的纯化工艺研究

植物多酚是分子中具有多个羟基的酚类总称，主要存在于植物的叶和皮中。目前，提取植物多酚可采用溶剂提取法、超声提取法、微波浸提法和大孔树脂纯化法等；大孔树脂纯化法具有选择性好、效率高和能耗低等特点[17]。

大孔树脂是三维网状结构的高聚物，它对甜茶多酚的吸附-解吸是相互竞争的过程，改变上样质量浓度、上样速率和洗脱液的体积分数等参数，将影响大孔树脂的吸附-解吸效果。崔紫姣[15]研究出HPD-100树脂纯化甜茶粗制样品的最佳上样液工艺条件(pH 4.0，2.5～5.0 mg·mL-1，2 BV·h-1)，洗脱液乙醇体积分数30%，得到甜茶多酚纯度为63%；林继元[18]研究 DM-301 树脂纯化甜茶粗制样品的最佳上样液参数(pH 5.5，2 mg·mL-1，1.2 BV·h-1)，洗脱液乙醇体积分数70%， 甜茶多酚得率为72.1%。

本研究以甜茶多酚为研究对象，对HPD-826、D101、LSA-21和AB-8树脂进行静态吸附-解吸性能的试验， HPD-826树脂对甜茶多酚表现出最好的吸附和解吸性能，其平均吸附率和平均解吸率分别为28.1%和 99.5%，因此HPD-826树脂最适合分离纯化甜茶多酚。HPD-826树脂的动态吸附试验结果表明，在相同流速下，随着上样液质量浓度的增加，HPD-826树脂对甜茶多酚的吸附率呈现减小趋势。这主要是由于甜茶多酚上样液的质量浓度越高，单位体积内多酚类化合物的分子数多，多酚类化合物与HPD-826树脂的接触量越大，传质速率降低；同时单位体积内增加的杂质量会与多酚类化合物形成竞争，导致HPD-826树脂对多酚化合物吸附率降低。若选择上样液质量浓度2.0 mg·mL-1，其平均吸附率达到最大值92.9%。上样流速是影响HPD-826树脂吸附甜茶多酚的重要因素之一；当上样流速为2和3 BV·h-1时，HPD-826树脂对应的累计上样体积分别为60和50 mL，此时出现渗漏点。考虑工业生产效率，选择50 mL上样液和2 BV·h-1流速为宜。HPD-826树脂对甜茶多酚的解吸率会随着洗脱液乙醇体积分数的增加表现出先增加后减小的趋势，当乙醇体积分数为60%时，HPD-826树脂对甜茶多酚解吸率可以达到最大值73.1%。因为当洗脱剂乙醇的体积分数较低时，它对甜茶多酚的洗脱不完全，得到的解吸率较低；当洗脱剂乙醇的体积分数较高时，其极性反而降低，溶出的极性较小的醇溶性杂质会与甜茶多酚类化合物形成竞争，降低甜茶多酚类化合物与乙醇-水分子结合的可能性，导致其解吸率降低[17-18]。综上所述， HPD-826树脂优化的动态工艺参数：上样液质量浓度、上样液体积和上样流速分别为2.0 mg·mL-1、50 mL和2 BV·h-1；洗脱剂乙醇体积分数、洗脱液体积、洗脱流速分别为60%、250 mL和 2 BV·h-1。在此优化条件下，甜茶多酚的平均纯度可以达到81.2%。

3.2 甜茶多酚不同萃取物对 α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制剂可以和人体小肠的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位结合，阻止餐后高血糖[16]。许多流行病学调查结果显示，饮茶能够降低血糖的水平和降低患糖尿病风险，具有α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用。Wu等[19]探讨了绿茶提取物在雄性 SD大鼠中对糖耐量的影响，发现绿茶水溶性成分可以提高胰岛素活力，具有明显的降血糖功效。Sabu等[20]研究表明，绿茶多酚能够抑制脂质过氧化，具有清除氧自由基和羟自由基等能力，降改善肝肾功能和低血糖水平，改善糖尿病病情。

不同极性溶剂萃取的甜茶多酚，其多酚类化合物结构差异较大，降糖效果也不同。本研究结果表明，在一定甜茶多酚质量浓度范围内(0.1～0.9 mg·mL-1)，阿卡波糖、乙酸乙酯相、HPD-826树脂纯化样品和粗制样品对ɑ-葡萄糖苷酶都有较好的抑制效果, 呈现出良好的“剂量-效率”正相关关系；当甜茶多酚质量浓度相同时，乙酸乙酯相和HPD-826树脂纯化样品对α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用均优于参照物阿卡波糖，乙酸乙酯相萃取物对应的抑制率最高，这主要是由于乙酸乙酯相富集了最多的抑制α-葡萄糖苷酶的茶多酚。因此，经过HPD-826树脂纯化的甜茶多酚乙酸乙酯萃取物具有开发成α-葡萄糖苷酶天然抑制剂的巨大潜力，后续的工作重点将对乙酸乙酯萃取物中的单体进行分离和分析，明确结构和药效的关系。

3.3 甜茶多酚不同萃取物对DPPH·的抗氧化性研究

天然植物的活性提取物的体外抗氧化能力检测通常使用DPPH·清除率检测法[14]。HPD-826树脂纯化样品、粗制样品、三氯甲烷相萃取物和乙酸乙酯相萃取物对DPPH·均有较好的清除能力，其强弱顺序为：乙酸乙酯相萃取物 > 参照物Vc> HPD-826树脂纯化样品> 粗制样品 >三氯甲烷相萃取物。在一定质量浓度范围内，DPPH·清除率均随着三氯甲烷相萃取物、粗制样品、HPD-826树脂纯化样品和乙酸乙酯相萃取的质量浓度增加而提高，其中DPPH·清除率对乙酸乙酯相萃取物质量浓度的响应最灵敏(IC50值仅为0.06 mg·mL-1)。因此，经过HPD-826树脂纯化的甜茶多酚乙酸乙酯萃取物具有开发成天然抗氧化剂的巨大潜力，拓宽甜茶深加工领域，推动甜茶区经济持续快速的发展。