麸炒枳实炮制工艺研究及质量分析

彭致铖，蔡盛康，罗思妮，魏梅，孙冬梅，朱德全

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，具有破气消积、化痰散痞的功效。枳实历代有清炒、炒黄、炒黑、麸炒、面炒、醋炒、酒炒、土炒、蜜炙等多种炮制方法。历代医药典籍中枳实使用主要以炒（炙）或麸炒为主，临床上多以麸炒枳实入药。枳实主要含挥发油、黄酮类化合物和辛弗林等化学成分，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黄酮类化合物属于枳实的有效成分，辛弗林属于枳实的活性成分[1-3]。辛弗林对于胃、肠运动具有调节作用，有较强的扩张气管和支气管的作用[4]。谢杞等[5]研究发现，辛弗林对CUMS大鼠具有抗抑郁的作用。2020版《中国药典》中仅收载了麸炒枳实，且只规定了辅料用量范围，无具体炮制工艺参数[6]，故有必要对麸炒枳实炮制工艺进行优化。本研究以特征图谱作为定性指标，饮片性状为炮制程度判断指标，柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林质量分数作为定量指标，采用L9（34）因素水平表与主成分分析法，优选麸炒枳实最佳炮制工艺，以期为其大生产的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Arc高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XP26百万分之一天平、ME204E万分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；HF-25型多功能炒果子机（万江富顺机械厂）。

1.2 试药

辛弗林（批号：1107023-201608）、柚皮苷（批号：110722-201714）、橙皮苷（批号：110721-201617）、新橙皮苷（批号：111857-201703）对照品均购于中国食品药品检定研究院；液相色谱用甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为超纯水。

1.3 样品

15批枳实药材采自江西吉安市、九江市、宜春市与湖南益阳市，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果。15批药材与辅料经广东一方制药有限公司质量中心检测，均符合2020版《中国药典》规定，详见表1。

表1 15批枳实生品、炮制品样品信息Table 1 The Information of 15 batches of raw Fructus Aurantii immaturus and processed products

2 方法与结果

2.1 麸炒枳实特征图谱与黄酮类质量分数的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：224 nm；进样量：对照品溶液10μL，供试品溶液5μL；乙腈为流动相A，0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸钠溶液为流动相B，梯度洗脱程序详见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林对照品适量，置50 mL量瓶中，加50%（体积分数，下同）甲醇溶解并稀释至刻度，即得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林质量浓度分别为0.038、0.051、0.054、0.042 mg/mL的混合对照品溶液。

另精密称取柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得柚皮苷、新橙皮苷质量浓度分别为0.113、0.110 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过65目筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4 .1 标准曲线 精密吸取质量浓度为18.08、72.33、144.65、289.31、578.63、1 157.25μg/mL的柚皮苷对照品溶液10μL与质量浓度为19.06、76.23、152.45、304.91、609.82、1 219.64μg/mL的新橙皮苷对照品溶液10μL，按“2.1.1 ”项色谱条件测定，以对照品的量对峰面积进行回归分析，得柚皮苷回归方程y=15 040x+56 907（r2=0.999 3），新橙皮苷回归方程y=12 065x+167 573（r2=0.999 6），柚皮苷在18.08～1 157.25μg/mL范围内具有良好相关性，新橙皮苷在19.06～1 219.64μg/mL范围内具有良好相关性。2.1.4 .2 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.1.1 ”项色谱条件测定，重复进样6次，以新橙皮苷峰为参照峰，计算其余各特征峰相对峰面积RSD值为0.29%，柚皮苷RSD为1.03%，新橙皮苷RSD为0.89%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 .3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.1.1 ”项色谱条件，分别于0、3、6、9、12、18、24 h测定。以新橙皮苷峰为参照峰，计算其余各特征峰相对峰面积RSD值为1.48%，柚皮苷RSD为1.22%，新橙皮苷RSD为1.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定。2.1.4 .4 重复性试验 精密称取麸炒枳实样品6份，分别按“2.1.3 ”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1 ”项下色谱条件测定，以新橙皮苷峰为参照峰，计算其余各特征峰相对峰面积RSD值为1.00%，柚皮苷RSD为0.52%，新橙皮苷RSD为0.48%，表明样品具有良好的重复性。

2.1.4 .5 加样回收率试验 精密称取已知含量麸炒枳实样品9份，每份0.2 g，分别加入柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，分别按“2.1.3 ”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1 ”项色谱条件测定，结果测得柚皮苷平均加样回收率为100.84%，RSD为0.94%，新橙皮苷平均加样回收率为98.54%，RSD为0.76%，表明方法准确性良好。

2.1.5 特征图谱的建立 吸取“2.1.2 ”项下柚皮苷、橙皮苷、新橙皮与辛弗林混合对照品溶液和“2.1.3 ”项下供试品溶液和空白溶剂各5μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。经与对照品进行比较，确认峰3为柚皮苷、峰4为橙皮苷、峰5为新橙皮苷、峰7为辛弗林。

图1 麸炒枳实特征图谱Figure 1 The characteristic chromatograms of stir-fried Fruc‐tus Aurantiiimmaturus with bran

2.1.6 枳实特征图谱共有模式的建立 取“1.3”项15批不同来源的枳实与麸炒枳实，按“2.1.3 ”项方法制备供试品溶液，再按“2.1.1 ”项色谱条件进行测定。将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，选择7个峰面积稳定且分离度较好的色谱峰，确定其为共有峰。15批枳实与麸炒枳实HPLC特征图谱叠加图见图2和图3。

图2 15批枳实特征图谱共有模式Figure 2 The common pattern of 15 batches of Fructus Aurantiiimmaturus

图3 15批麸炒枳实特征图谱共有模式Figure 3 The common pattern of characteristic chromato‐grams of 15 batches of stir-fried Fructus Aurantiiimma‐turus with bran

2.2 麸炒枳实中辛弗林质量分数的测定

精密称取麸炒枳实粉末，参照2020年版《中国药典》一部枳实项下辛弗林质量分数测定方法进行测定[6]，色谱图见图4。

图4 辛弗林质量分数测定色谱图Figure 4 The chromatograms of synephrine

2.3 麸炒枳实炮制工艺研究

2.3.1 正交试验设计 取其中一批大小均匀的枳实饮片，均分成9份，每份取150 g，准确称定，分别加入适量麦麸，炒至色变深，即得。以炒制温度、炒制时间与加麸量为考察因素，按L9（34）因素水平表设计，各因素与水平见表3。

表3 正交设计表因素与水平Table 3 The factors and levels of Orthogonal design

2.3.2 正交试验方法与结果 将炒药机加热至设定温度，均匀撒入定量麦麸，即刻烟起，投入净枳实片，快速翻动，炒至色变深，取出，筛去麦麸，即得[6]。

采用综合评分法，将9次试验中柚皮苷质量分数最高的试验数据定为100，其他各次试验数据与其相比即为得分，同法进行新橙皮苷与辛弗林的评分。将9次试验中所得饮片性状与2020年版《中国药典》麸炒枳实项下所描述性状对比，选择3～5人作出评分，取平均值。2020年版《中国药典》对麸炒枳实的性状与辛弗林质量分数均有规定且辛弗林为枳实主要活性成分，对胃肠运动具有调节作用，故加权系数均为0.3，柚皮苷与新橙皮苷质量分数加权系数均为0.2。将4个指标通过加权系数计入综合评分，由综合评分确定所选指标的优劣，结果见表4。直观分析见表5，方差分析见表6。

从表4的直观分析数据可以看出，影响因素对极差R的影响顺序从大到小为因素A>因素B>因素C>空白，即炒制温度>炒制时间>加麸量>空白；结合各因素水平，最佳工艺参数为A1B1C3。

表4 麸炒枳实炮制正交设计试验结果Table 4 he results of orthogonal design for processing of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

从表5方差分析数据可以看出，炒制温度对麸炒枳实炮制质量的影响有统计学意义（P<0.05），而炒制时间与加麸量则无统计学意义。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of Variance Table

综上所述，由于加麸量对麸炒枳实炮制无明显影响，再结合传统经验及大生产经济性考虑，确定最佳工艺参数为A1B1C1，即每100 kg麸炒枳实用麦麸量为10 kg，炒制温度为220℃，炒制5 min。

2.3.3 主成分分析 以新橙皮苷为参照峰，其余6个特征峰的相对峰面积为变量，采用SPSS21.0软件进行主成分分析，得特征值和方差贡献率见表6，碎石图见图5。可见，以特征值＞1并考虑碎石图连续陡峭部分，可以提取得到2个主成分，累计方差贡献率为83.114%，说明这2个成分可以代表83.114%的信息，具有良好的代表性。因子载荷矩阵见表7，从中可见，峰1、柚皮苷、辛弗林对主成分1贡献较大，峰2对主成分2贡献较大。

图5 麸炒枳实主成分分析碎石图Figure 5 The Gravel map of principal component analysis of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

根据表6和表7的数据，将原始数据标准化后，进一步计算得到2个主成分得分的特征向量，将其与标准化数据相乘后得到2个主成分得分F1、F2：

表6 麸炒枳实主成分分析特征值与方差贡献率Table 6 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

表7 因子载荷矩阵Table 7 Factor load matrix

F1=0.518ZX1+0.174ZX2+0.530ZX3+0.188ZX4+0.329ZX5+0.525ZX6，

F2=0.077ZX1+0.659ZX2+0.010ZX3+0.408ZX4−0.623ZX5−0.060ZX6，

式中：ZX1～ZX6分别为峰1（X1）、峰2（X2）、柚皮苷（X3）、橙皮苷（X4）、峰6（X5）、辛弗林（X6）的标准化数据。

以各主成分得分所对应的方差贡献率为系数，从而得到综合评分模型F，F表达式为：F=0.583 34F1+0.247 80F2。9次实验综合得分见表8。综合得分排名最高的为1号实验，与正交实验方差分析得出结果一致。最终确定最优炮制工艺参数为每100 kg麸炒枳实用麦麸量为10 kg，炒制温度为220℃，炒制5 min。

表8 主成分综合得分排名Table 8 Comprehensive score ranking of main componen

2.3.4 工艺验证

取枳实饮片，按上述最佳工艺参数，重复制备麸炒枳实饮片3份，按上述方法测定，测定其特征图谱和柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林的质量分数，见表9。结果表明，麸炒枳实炮制工艺参数重复性良好。

表9 麸炒枳实中3种成分质量分数的测定结果Table 9 Determination of the mass fraction of three compo‐nents in stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

2.3.5 生品与炮制品的差异分析

取15批不同产地枳实药材，按上述最佳工艺参数，制备15批麸炒枳实饮片，按“2.1.3 ”项方法制备供试品溶液，再按“2.1.1 ”项色谱条件进行测定，以新橙皮苷为参照峰，计算其余各峰的相对峰面积，结果见表10～表11。

表10 枳实药材特征图谱相对峰面积Table 10 Relative peak area of the characteristic chromatogramsof Fructus Aurantiiimmaturus

表11 麸炒枳实饮片特征图谱相对峰面积Table 11 Relative peak area of characteristic chromatograms of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

对比15批不同产地枳实与麸炒枳实的特征图谱的结果发现，经过麸炒后，未知成分峰1除个别批次外，相对峰面积均有不同程度的降低；未知成分峰6除个别批次外，相对峰面积均有不同程度的增加，说明枳实与麸炒枳实化学成分比例存在一定的差异。有研究表明枳实麸炒后挥发油的含量有所减少，而挥发油组分与其他主要化学成分变化不大[7-8]。

3 讨论

本研究比较了不同的流动相体系（乙腈-0.1%甲酸和0.1%十二烷基硫酸钠、乙腈-0.1%磷酸和0.1%十二烷基硫酸钠、乙腈-0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸钠）、不同提取方式（超声、回流）、不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、不同提取时间（15 min、30 min、60 min）、不同提取溶剂用量（50 mL、100 mL），结合柚皮苷、新橙皮苷质量分数与各色谱峰数量和分离效果考虑，最终确定用甲醇超声提取供试品溶液，以乙腈-0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸钠为流动相的色谱条件。色谱柱选择能较好分离碱性化合物与耐高水相的Waters Sym‐metry色谱柱，能实现对麸炒枳实中的黄酮和生物碱（辛弗林）的同时分离。

本研究从枳实及麸炒枳实的HPLC特种图谱中标识出7个共有峰，通过对照品指认了其中4个成分，分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林。通过15批不同产地的枳实与麸炒枳实的特征图谱可知，枳实经过炮制后并无化学成分消失或产生新的物质，但未知成分峰1除个别批次外，相对峰面积均有不同程度的降低，推测峰1为挥发油成分，经麸炒后达到“缓和其峻烈之性[9]”的效果；未知成分峰6除个别批次外，相对峰面积均有不同程度的增加，推测未知成分峰6与麸炒枳实的药效“以散积消痞力胜[9]”有关。但对于具体的化学成分的变化与缓和枳实的破气之功的关系，还有待进一步研究。

目前，对麸炒枳实炮制工艺研究已有文献报道[1,10-11]，但因年代较久，参考《中国药典》的版本不一，导致得出的结论已不符合2020年版《中国药典》炮制通则项下的规定。本研究参考2020年版《中国药典》，通过正交实验方差分析与主成分分析，优选出麸炒枳实炮制工艺，且炮制考察所用的炒药机是模拟的大生产炮制设备，对麸炒枳实大生产的质量控制具有一定的指导性。