阿里红多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

姜晓杰，吉家兴

（广东省第二人民医院药学部，广东广州 510317）

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/re‐perfusion injury，MIRI）是指心肌血液供应中断，而心肌一定时间内恢复血流，但原缺血心肌出现较缺血前更为严重的损伤。再灌注心脏伴随而来的病理变化有心率失常、舒缩障碍、代谢异常和超微结构改变等[1]。其发病机制复杂，仍需进一步的研究探讨。有研究[2-5]表明其发病机制可能与氧化应激、炎症反应、Ca2+超载、细胞凋亡和自噬等多方面相关。阿里红（Fomes off icinalis Ames）作为一种多孔菌科层孔菌属干燥子实体，其有着广泛的民族用药基础，是我国新疆地区常用的道地药材。据医书记载其具有温胃祛痰、祛风除湿、消肿利尿、降气平喘的功效，临床上常用于慢性支气管炎、腹痛、感冒、癌症等疾病的治疗。阿里红多糖是其主要有效成分之一。阿里红多糖具有较好的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性[6-8]。目前，阿里红多糖对MIRI的作用尚未见相关研究报道。本研究拟以大鼠MIRI模型为研究对象，观察阿里红多糖对心肌缺血再灌注损伤的影响，并以凋亡信号通路Bax/Bcl-2/Caspase-3为靶点探究其抗MIRI的作用机制。

1 材料

1.1 仪器与试剂

BL-420F生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；小动物呼吸机，上海软隆科技发展有限公司；阿里红，宁波德康生物制品有限公司；氯化硝基四氮唑蓝(NBT），上海弘顺生物科技有限公司；地塞米松片：规格：0.75 mg/片，广东南国药业有限公司；羊抗鼠Bcl-2和羊抗鼠caspase-3一抗，碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，齐一生物科技（上海）有限公司。

1.2 动物与分组

SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g，购自广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(粤)2014-0005。大鼠适应性喂养2周后，按体质量随机分为6组，分别为假手术组、模型组、DEX组、ALH-L组、ALH-M组和ALH-H组，每组10只。各给药组于造模前预防给药1周，除假手术组和模型组灌胃给予等量生理盐水外，其中DEX组灌胃给予地塞米松0.8 mg/(kg·d)，ALH-L、M、H组分别灌胃给予阿里红多糖10、20、40 mg/(kg·d)。

2 方法

2.1 阿里红多糖提取方法

主要参照文献[9]的方法提取阿里红多糖，主要方法如下：粉碎机粉碎阿里红1 kg，烤箱中60℃干燥至恒重。称取500 g置于回流提取器中，加入95%（φ）乙醇2 000 mL，回流提取4 h，过滤，保留滤液。再加入95%乙醇1 000 mL回流提取药渣3次，每次提取1 h，过滤。药渣再用60℃热水回流提取3次。先加蒸馏水1 000 mL，60℃下提取4 h再加入500 mL蒸馏水2次，分别提取1 h。合并提取液，离心除去沉淀。将上述合并的提取液采取减压浓缩方法减至100 mL，随后加入无水乙醇使其含醇量达80%，置于4℃环境过夜。取出提取液抽滤，使用95%乙醇、无水乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤沉淀3次，每次50 mL，于干燥箱内50℃干燥，产物为阿里红多糖，共4.2 g。将阿里红多糖加水溶解，以硫酸-苯酚法测定测得多糖百分含量为85.52%，即每克阿里红含多糖7.18 mg。

2.2 大鼠MIRI模型的建立

大鼠腹腔注射2%异戊巴比妥钠腹腔麻醉后，仰卧固定，行气管插管并连接呼吸机（潮气量为4 mL/100 kg，呼吸频率为60次/min，呼吸比为1.2∶1），Ⅱ导联心电图监测，连续记录。于大鼠胸骨左缘第3与4肋之间开胸，小心暴露心脏。用无创缝合线6/0丝线在LAD下穿处，于左心房与肺动脉圆锥之间处结扎，阻断血流，结扎缺血30 min后开胸及剪断结扎线，再灌注23.5 h，术后注射青霉素防止感染。结扎成功标准：肉眼可见结扎线下心脏左室壁变暗变紫，心尖部变白，心电图示ST段明显上抬。再灌注成功的标准:左心室变红润，ST段回落。假手术组只穿线不结扎。

2.3 大鼠心脏梗死率检测

小心摘取心脏，生理盐水冲洗干净，切取心脏结扎线以下部分，切取2 mm的心肌组织，使用1%NBT染液于37℃孵育染色20 min，中性甲醛固定，拍照，应用Image-Pro Plus软件分析，梗死率=梗死面积/总面积×100%。

2.4 生化指标和Western blot检测

按照试剂盒说明书使用酶标仪检测血浆CK、LDH、SOD活性和TNF-α、IL-1β、MDA含量。提取缺血心肌组织中的总蛋白，按常规Western blot检测步骤检测Bcl-2和caspase-3的表达量，在凝胶成像系统中进行灰度值的计算和分析。

2.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行分析。所有实验数据计量资料用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 阿里红多糖对大鼠MIRI模型心电图的影响

与假手术组比较，模型组心电图ST段显著升高（P<0.01）；与模型组比较，DEX组和ALH给药组心电图ST段显著降低（P<0.05）；与ALH-L组比较，ALH-H组心电图ST段显著降低（P<0.01）。见图1、2。

图1 心电图变化Figure 1 Change of electrocardiogram

图2 ST段上抬量Figure 2 Lifting of ST segment

3.2 阿里红多糖对大鼠MIRI模型心脏梗死率的影响

模型组心脏梗死率较假手术组显著升高（P<0.01）；与模型组比较，DEX组和ALH给药组心脏梗死率显著降低（P<0.05）；与ALH-L组比较，ALH-H组心脏梗死率显著降低（P<0.05）。见图3、4。

图3 各组心脏梗死面积变化(NBT染色)Figure 3 Changes of cardiac infarction area in each group(NBTstaining)

3.3 阿里红多糖对大鼠MIRI血浆CK和LDH活性的影响

与假手术组比较，模型组CK和LDH活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，DEX组和ALH给药组CK和LDH活性显著降低（P<0.05）；与ALH-L组比较，ALH-H组CK和LDH活性均显著降低（P<0.05）。见图5、6。

图5 各组血浆CK活性变化（x±s）Figure 5 Changes of plasma CK activity in each group(x±s)

3.4 阿里红多糖对大鼠MIRI血浆TNF-α和IL-1β含量的影响

图4 各组心脏梗死率变化Figure 4 Change of cardiac infarction rate

图6 各组血浆LDH活性变化（x±s）Figure6 Changesof plasma LDHactivity in each group(x±s)

与假手术组比较，模型组TNF-α和IL-1β含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，DEX组和ALH给药组TNF-α和IL-1β含量显著降低（P<0.05）；与DEX组比较，ALH-H组TNF-α和IL-1β含量显著降低（P<0.05）；与ALH-L组比较，ALH-H组TNF-α和IL-1β含量显著降低（P<0.05）。见图7、8。

图7 各组血浆TNF-α含量变化（x±s）Figure7 Changesof plasmaTNF-αcontentineachgroup(x±s)

2.5 阿里红多糖对大鼠MIRI血浆SOD和MDA的影响

模型组SOD活性较假手术组显著降低，MDA含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，DEX组和ALH给药组大鼠SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.05）；与ALH-L组比较，ALH-H组大鼠SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.05）。见图9、10。

图9 各组血浆SOD活性变化（x±s，U/mL）Figure 9 Changes of plasma SOD activity in each group(x±s,U/mL）

2.6 阿里红多糖对大鼠MIRI心肌缺血组织Bcl-2和caspase-3表达的影响

图8 各组血浆IL-1β含量变化（x±s）Figure8 Changesof plasma IL-1βcontentineachgroup(x±s)

图10 各组血浆MDA含量变化（x±s）Figure 10 Changes of plasma MDA content in each group(x±s)

与假手术组比较，各组caspase-3表达量显著升高，而Bcl-2表达量显著降低（P<0.01）；与模型组相比较，DEX组和ALH给药组caspase-3表达量显著降低，Bcl-2表达量显著升高（P<0.05）；与ALH-L组比较，ALH-H组caspase-3表达量显著降低，Bcl-2表达量显著升高（P<0.05）。见图11。

图11 各组心肌缺血组织Bcl-2和caspase-3的表达（x±s）Figure 11 Expression of Bcl-2 and caspase-3 in myocardial ischemia tissues of each group(x±s)

3 讨论

目前，溶栓治疗实现血流再通是临床上防治急性心肌梗死的主要方案，但由此引起的再灌注损伤严重影响患者的预后，其发病机制至今尚未完全阐明。有研究[2-5]表明其发病机制可能与氧化应激、炎症反应、Ca2+超载、细胞凋亡和自噬等多方面相关。地塞米松是一种具有强大的抗炎、抗免疫和抗休克等多种药理作用的甾体类糖皮质激素，但如长期大剂量使用，可引起较多的不良反应。较多研究发现[10-12]地塞米松可改善MIRI相关症状，如心律失常、心脏梗死率等，故本研究选择地塞米松作为阳性对照药。

阿里红多糖具有较好的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性。此外，其毒性较小。有研究[13]报道小鼠口服阿里红多糖，其半数致死量(LD50)为6.31 g/kg。目前阿里红多糖对MIRI的研究未见到相关报道，本研究发现阿里红多糖具有确切的抗大鼠MIRI作用。心肌损伤或者坏死后，心肌会释放CK和LDH入血，血清CK和LDH活性会显著升高。故临床上常采用CK、LDH活性来评价MIRI患者心肌细胞损伤的严重程度及愈后，而心脏梗死面积可作为心肌细胞损伤比较直观的评价指标。本研究发现模型组心肌梗死率、CK和LDH活性显著升高，提示大鼠MIRI造模成功，给阿里红多糖可有效保护缺血心肌，降低心肌梗死率和CK、LDH活性。TNF-α与IL-1β是两种具有重要生物活性的细胞因子。两者参与了炎症所致心肌损伤的整个病理过程，其水平高低反映机体的炎症水平。本研究发现阿里红多糖可明显减轻炎症，呈剂量依赖性，提示阿里红多糖可能通过抗炎作用减轻MIRI。SOD可清除机体H2O2和OH·等氧自由基，保护机体免受氧自由基的损害。MDA是机体膜脂过氧化过程中所产生的一种毒性醛类物质，也是氧化应激的标志物之一。两者的体内水平可反映机体氧化应激的严重程度。本实验研究结果表明阿里红多糖可明显减轻氧化应激损伤，呈剂量依赖性，提示阿里红多糖可能通过抗氧化损伤作用减轻MIRI。caspase-3和Bcl-2是凋亡通路中的两个重要的凋亡因子，参与细胞凋亡过程。caspase-3可促进细胞凋亡，而Bcl-2通过抑制cas‐pase-3激活、阻止细胞色素C释放和降低细胞内钙浓度，从而抑制细胞的凋亡。实验结果显示阿里红多糖可显著降低缺血心肌的凋亡，提示阿里红多糖可能通过抗凋亡作用减轻MIRI。

综上所述，阿里红多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有较好的保护作用，抗氧化、抗炎和抗凋亡可能是其重要的作用机制。