氟苯尼考自微乳给药系统的制备及其质量评价

谢芸 1，吴海燕 1，刘雯君 1，胡巧红

（1.广东药科大学药学院，广东广州 510006；2.广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东广州510006）

氟苯尼考（florfenicol，FF）又名氟甲砜霉素，系甲砜霉素的单氟衍生物，是美国Schering-Plough公司于1988年研发的新型动物专用的第三代氯霉素类广谱抗生素[1]。从药效上看，氟苯尼考比氯霉素及甲砜霉素具有更高的抗菌活性[2]，能抑制或杀死耐氯霉素及甲砜霉素的细菌，且没有潜在的致再生障碍性贫血的缺点，更没有致畸、致癌和致突变的缺陷。目前，该药在兽医临床上应用非常广泛，但是氟苯尼考水溶性较差，在水中溶解度为1.51 mg/mL[3]，严重影响氟苯尼考的生物利用度。因而，改善氟苯尼考的溶解性能是增加氟苯尼考生物利用度的关键[4]。

自微乳给药系统（self-microemulsion drug deliv‐ery system，SMEDDS）是由药物、油相、乳化剂和助乳化剂形成的均一澄清液体，口服遇到胃肠液后在胃肠道的蠕动下自发分散形成O/W型、粒径小于100 nm的乳剂[5-6]。SMEDDS口服后能在胃肠道快速、均匀分布，可作为难吸收、疏水性或易水解药物的载体[7]。自发形成的乳滴有巨大的比表面积，可提高难溶性药物的吸收[8]。此外，形成的微乳可保护药物，避免在胃肠道中被酶解，增加药物的稳定性；微乳还可通过淋巴循环系统，克服药物的首过效应[9]。星点设计-响应面优化法是通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面上选择较佳的效应区，从而回推出自变量取值范围即最佳实验条件的优化法。该法具有实验次数少、精度高等特点，使用起来直观、方便，常用于制剂工艺和处方筛选[10]。本文设计将氟苯尼考制成自微乳给药系统（FFSMEDDS），通过伪三元相图法结合星点设计-响应面法优化处方，以改善氟苯尼考的溶解度，达到速效、高效的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Techcomp FA2004B电子分析天平（上海天美天平仪器有限公司）；VORTEX GENIUS 3涡旋混匀器（德国IKA集团）；TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）；TS-100B恒温振荡器[匡贝实业（上海）有限公司]；HPX-9162 MBE数显不锈钢电热培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；NanoBrook 90Plus PALS高灵敏Zeta电位及粒度分析仪（美国布鲁克海文仪器公司）；Multiskan FC酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；JEM-2100HR 200kV透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

1.2 试药

氟苯尼考对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号wkq19080802）；氟苯尼考原料药（湖北龙翔药业科技股份有限公司，批号180414）；大豆油（广州白云山汉方现代药业有限公司）；油酸（天津市致远化学有限公司）；柠檬酸三乙酯、辛癸酸甘油三酯、吐温85、聚氧乙烯蓖麻油（EL）、维生素E琥珀酸酯（TPGS）均由上海麦克林生化科技有限公司提供；吐温80、聚氧乙烯烷基酚醚（乳化剂OP-10）、聚乙二醇400（PEG400）、丙二醇均由天津市大茂化学试剂厂提供；二乙二醇乙醚（transcutol，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；蒸馏水（屈臣氏集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定样品中氟苯尼考的质量浓度[11]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：菲罗门Luna C18(2)（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（体积比40∶60）；流速：1.0 mL/min；进样量：20μL；柱温：室温；检测器：紫外检测器；检测波长：224 nm。

2.1.2 氟苯尼考对照品储备液的制备 精密称取50 mg氟苯尼考对照品，置于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制得500μg/mL的对照品储备液。

2.1.3 专属性考察 取适量氟苯尼考对照品储备液，经适当稀释得到40μg/mL的对照品溶液，将对照品溶液与空白辅料溶液、氟苯尼考自微乳样品溶液，按“2.1.1 ”项下色谱条件分别进行测定，考察方法的专属性，结果见图1。可见，氟苯尼考在6 min左右出峰，空白辅料不干扰氟苯尼考的测定，方法专属性良好。

图1 氟苯尼考对照品（A）、氟苯尼考自微乳（B）和空白辅料（C）的HPLC图Figure 1 The HPLC chromatographs of Florfenicol(A),FFSMEDDS(B)and excipients(C)

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密移取500μg/mL的氟苯尼考对照品储备液，经适当稀释得到5、10、20、40、60、80、100μg/mL的 对 照 品 溶 液。按“2.1.1 ”项色谱条件进行测定，以峰面积（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，得回归方程y=42.484x+2.043 4（R2=1），表明在5～100μg/mL范围内线性良好。

2.1.5 精密度考察 日内精密度：分别精密移取适量氟苯尼考对照品储备液，用流动相稀释，得到10、40、80μg/mL的对照品溶液，按“2.1.1 ”项下色谱条件，在同一天内进行测定，结果计算得3种浓度溶液的RSD值分别为0.17%、0.20%、0.15%，符合规定。

日间精密度：取上述低、中、高3个不同浓度的对照品溶液，按“2.1.1 ”项下色谱条件，每天测定1次，连续测定3 d，结果计算得3种浓度溶液的RSD值分别为0.05%、0.03%、0.08%，符合规定。

2.1.6 稳定性考察 分别精密移取适量对照品储备液，用流动相稀释，得到10、40、80μg/mL的对照品溶液。分别在0、2、4、6、8、10 h时，按“2.1.1 ”项下色谱条件测定，结果计算得RSD值分别为0.10%、0.03%、0.02%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.1.7 回收率的测定 取一定量已知浓度的氟苯尼考自微乳样品液，置于10 mL容量瓶中，加入适量氟苯尼考对照品储备液，用流动相稀释定容，制得低、中、高3种浓度的溶液。按“2.1.1 ”项下色谱条件，每个浓度平行测定3次，结果见表1。可见，低、中、高3种浓度溶液的平均回收率分别为99.15%、100.73%、99.92%，RSD分 别 为0.20%、0.16%、0.07%，符合规定。

表1 氟苯尼考回收率测定结果Table 1 Recoveries of Florfenicol

2.2 溶解度的测定

分别取过量氟苯尼考原料药，置于25 mL带塞锥形瓶中，加入各辅料5 mL，涡旋混合5 min，于37℃、100 r/min气浴恒温振荡器中振荡72 h，使溶解达到平衡，将样品以8 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22μm滤膜，取适量滤液用流动相稀释后，按“2.1.1 ”项色谱条件测定，计算氟苯尼考质量浓度即为药物溶解度，结果见表2。可见，氟苯尼考在油相柠檬酸三乙酯中的溶解度显著大于大豆油、油酸和辛癸酸甘油三酯，在乳化剂吐温80、OP-10、EL、TPGS中的溶解度优于吐温85，在助乳化剂transcutol、PEG400中的溶解度明显大于丙二醇。

表2 氟苯尼考在各辅料中的溶解度Table 2 Solubility of Florfenicol in different excipients

2.3 油相、乳化剂和助乳化剂的筛选

2.3.1 油相与乳化剂相容性考察 称取比例为4∶6的油相与乳化剂，混合均匀，取一定量混合物滴入37℃、100倍量的蒸馏水中，于转速为100 r/min的磁力搅拌器中搅拌，记录自乳化时间和溶液外观性状，筛选合适的油相和乳化剂。按文献[12]方法，目测等级设定为：A级，乳化时间<1 min，溶液澄清或微泛蓝光；B级，乳化时间<1 min，溶液略浊，呈蓝白色；C级，乳化时间2 min内，溶液较黏稠，呈亮白色不透明液体；D级，乳化时间>2 min，呈灰白色，略带油状；E级，难乳化，一直有油滴存在。

从表3可见，柠檬酸三乙酯与乳化剂OP-10及EL形成的微乳的评级较高，故选用柠檬酸三乙酯为油相、乳化剂OP-10和EL为乳化剂继续筛选助乳化剂。

表3 油相与乳化剂配伍的评级结果Table 3 Grading results of compatibility of oil phases and emulsifiers

2.3.2 助乳化剂筛选 先将乳化剂OP-10、EL分别与助乳化剂按1∶1比例混合均匀，再与油相柠檬酸三乙酯以4∶6的比例混合均匀。取一定量混合物滴入37℃、100倍量的蒸馏水中，于转速为100 r/min的磁力搅拌器中搅拌，观察现象并评级（方法参见“2.3.1 ”项），结果见表4。

表4结果显示，柠檬酸三乙酯为油相、乳化剂OP-10为乳化剂时，与助乳化剂transcutol、PEG400、1,2-丙二醇形成的微乳评级均较高。结合“2.2”项的溶解度测定结果，氟苯尼考在1,2-丙二醇中的溶解度较低，故确定以柠檬酸三乙酯为油相，以乳化剂OP-10、EL为乳化剂，以transcutol、PEG400为助乳化剂，进行进一步筛选。

表4 柠檬酸三乙酯为油相的乳化剂和助乳化剂配伍的评级结果Table 4 Grading results of compatibility of emulsifiers and coemulsifiers for triethyl citrate as oil phase

2.3.3 伪三元相图法筛选乳化剂、助乳化剂 以柠檬酸三乙酯为油相，分别以乳化剂OP-10、EL为乳化剂，以transcutol、PEG400为助乳化剂，固定乳化剂与助乳化剂的比值（Km）为2，油相与混合乳化剂按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混合，采用微板稀释法绘制伪三元相图。将油相和混合乳化剂以减幅为10μL，从200μL到0μL，水则以10μL的增幅从0μL到200μL，加入96孔板中。每个孔做3个复孔，每个比例以同样步骤填充，将填充好的96孔板置于孔板振荡器上振摇30 min使充分混匀，然后用多功能酶标仪于650 nm波长处测定吸光度[13]。以吸光度突变的点为临界点，采用Origin 8.0软件绘制伪三元相图确定微乳区域，结果见图2。

由图2可知，当油相为柠檬酸三乙酯、乳化剂为乳化剂OP-10、助乳化剂为transcutol时，形成的自微乳区域最大，故选择乳化剂OP-10为乳化剂、trans‐cutol为助乳化剂，继续进行处方优化。

图2 柠檬酸三乙酯为油相的乳化剂和助乳化剂的伪三元相图Figure 2 Pseudo ternary phase diagrams of emulsifiers and coemulsifiers for triethyl citrate as oil phase

2.4 星点设计-响应面优化法优化FF-SMEDDS处方

采用二因素、五水平的星点设计-响应面优化法对FF-SMEDDS的处方进行优化。选择对自微乳形成有显著影响的2个因素，即油相柠檬酸三乙酯的质量百分比（X1）、乳化剂OP-10与助乳化剂transcu‐tol的质量比Km（X2）。根据伪三元相图中的自微乳区域范围，以溶解度（Y）为评价指标，确定各因素的取值范围，油相的质量百分比（X1）的取值范围为10%～80%，乳化剂与助乳化剂的质量比Km（X2）的取值范围为1～9，因素水平见表5。

表5 因素与水平Table 5 Factors and levels

按表6中处方，精密称取各辅料共6 g于50 mL带塞锥形瓶中，涡旋混匀5 min，加入过量氟苯尼考原料药，涡旋混匀5 min。然后置于温度为37℃、转速为100 r/min恒温振荡器中，振荡72 h，使溶解达到平衡，将样品以8 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22μm滤膜，取一定量滤液用流动相适当稀释后，按“2.1.1 ”项色谱条件测定氟苯尼考质量浓度，即为溶解度。

表6 星点设计优化FF-SMEDDS的结果Table 6 Results of FF-SMEDDSoptimized by central compositedesign

采用Design-Expert 11软件，以溶解度作为因变量，分别对各因素（自变量）各水平进行二项式拟合，得到方程式：Y=57.970 00−6.472 98X1−5.051 03X2+1.810 00X1X2−1.465 62X12+5.501 87X22，方差分析结果见表7。

表7 方差分析结果Table 7 Analysis results of variance

以上述数学模型为基础，描绘三维因变量，绘制3D效应面图，见图3。由此综合分析获得优化处方为：柠檬酸三乙酯31.78%、乳化剂OP-10 34.63%、transcutol 33.59%。

2.5 处方验证

根据上述得出的优化处方，制备3批FFSMEDDS，按“2.4”项下“精密称取各辅料共6 g于50 mL带塞锥形瓶中，……，即为溶解度”操作，测得药物溶解度为（80.39±0.60）mg/mL（n=3），与预测值（80.28 mg/mL）作比较，按公式：偏差（%）=|预测值-真实值|/预测值×100%，计算得偏差为0.14%，表明星点设计-响应面优化法具有较好的预测效果。此外，测得上述3批FF-SMEDDS的微乳粒径为（9.34±0.36）nm，PDI为0.111±0.034。

图3FF-SMEDDS的溶解度3D效应面图Figure3 Theresponsesurfacegraph(3D)ofthesolubility ofFF-SMEDDS

2.6FF-SMEDDS的制备及质量评价

2.6.1 FF-SMEDDS的制备 星点设计-响应面优化法中测定的为药物饱和浓度，为避免自微乳给药系统中药物处于饱和状态时易受环境影响而导致药物析出的问题，所以最终制备药物浓度低于饱和浓度的FF-SMEDDS。

按“2.4”优化后的处方制备3批FF-SMEDDS：精密称取各辅料共30g于50mL带塞锥形瓶中，涡旋混匀5min，加入1.5g氟苯尼考原料药，涡旋混匀10min得到溶液。

2.6.2 外观形态 FF-SMEDDS为无色澄清透明的黏稠状液体，加水自乳化后形成无色、均一透明的微乳，有乳光。电镜下观察到自乳化形成的微乳呈类球形，见图4。

2.6.3 粒径及分布 取适量FF-SMEDDS，用蒸馏水稀释100倍，使自乳化形成微乳，测定微乳的粒径及分布。形成的微乳粒径分别为（8.88±0.05）nm（PDI=0.139±0.018）、（9.18±0.04）nm（PDI=0.085±0.009）、（9.01±0.03）nm（PDI=0.085±0.008）。

2.6.4 药物质量浓度的测定 取适量FF-SMEDDS，用流动相稀释后，按“2.1.1 ”项色谱条件，测得3批FF-SMEDDS的药物质量浓度分别为48.35、48.08、48.14mg/mL。

2.6.5 离心稳定性 取适量FF-SMEDDS，加水稀释100倍，使自乳化形成微乳，在3000r/min转速下离心30min后，观察外观形态，可见仍为无色、均一透明的微乳液，无沉淀出现。

图4FF-SMEDDS自乳化形成微乳的透射电镜照片Figure4 Transmissionelectronmicrographofthemicro‐emulsionformedbyFF-SMEDDSindistilledwater

2.6.6 稳定性考察 将FF-SMEDDS分别置于4、30℃下，在第0、5、10、15、30d取出一定量样品，用流动相稀释后，按“2.1.1 ”项色谱条件测定药物浓度。另取适量样品，用蒸馏水稀释100倍，使自乳化形成微乳，测定粒径及分布，结果见表8。结果显示，FF-SMEDDS在4、30℃条件下放置30d，药物浓度的变化幅度均小于5%，自乳化后的微乳粒径在8.64～9.54nm之间，均无明显变化，说明体系在4℃和30℃条件下稳定。

表8 FF-SMEDDS稳定性考察结果Table 8 Stability of FF-SMEDDS

3讨论

通常，自微乳油相的质量百分比越大，对药物的溶解能力越强，但油相的用量对自微乳体系的稳定性有较大的影响[14]。本研究发现，氟苯尼考在柠檬酸三乙酯中的溶解度显著大于其他油相。这是因为与油酸、大豆油相比，辛癸酸甘油三酯、柠檬酸三乙酯的碳链更短，极性更大；与辛癸酸甘油三酯相比，柠檬酸三乙酯碳数更少，且支链更短，因此，推测柠檬酸三乙酯的极性最大，而氟苯尼考结构中含有卤素及磺酸基，极性与其最为接近，所以氟苯尼考能较好地溶解在柠檬酸三乙酯中。相容性考察发现，柠檬酸三乙酯与乳化剂形成的微乳的评级较高，故选用柠檬酸三乙酯为油相。乳化剂的种类及用量影响微乳的形成和稳定性；助乳化剂则主要起增加药物溶解度、调节亲水亲油平衡值（hydro‐phile-lipophilebalance，HLB）的作用，并能与乳化剂形成复合界面膜，促进微乳形成且增加其稳定性[15]。O/W型自微乳给药系统一般采用稳定性高、毒性低、HLB值为8～18的非离子型表面活性剂。本研究所选的乳化剂均为HLB值在该范围内的非离子表面活性剂，乳化剂OP-10与transcutol（2∶1）混合后的HLB值为12.22，与油相柠檬酸三乙酯所需的HLB值12.3最接近，因此该混合乳化剂的乳化效果较好，且与伪三元相图筛选结果相符，故最终确定处方组成为柠檬酸三乙酯、乳化剂OP-10和transcutol。

一般情况下，自微乳的星点设计-响应面优化选择粒径及溶解度作为考察指标。本研究测得各处方制备的微乳粒径介于7.64～11.65 nm之间。不同处方自微乳由于油相、乳化剂、助乳化剂的比例不同，形成的微乳粒径存在差异，但是各处方的微乳粒径均已很小，因此，粒径不作为处方优化的考察指标。此外，实验中还测定了各处方制备的微乳的Zeta电位，在−12.21～0.018 mV范围，可见处方中油相、乳化剂、助乳化剂的比例不同，微乳的Zeta电位存在一定差异。自微乳给药系统的质量评价不仅包括粒径及分布、药物质量浓度，也应包括稳定性考察。因此，本文对FF-SMEDDS进行了离心稳定性以及不同温度条件下的稳定性考察，结果显示，体系具有良好的离心稳定性，且在4、30℃条件下30 d内均保持稳定。

综上所述，将氟苯尼考设计成自微乳给药系统是可行的，可制得药物质量浓度较高、粒径分布均匀、体系稳定的氟苯尼考自微乳给药系统。