响应面法优化超声波辅助提取黑豆皮总黄酮工艺

李娜 1，杨蕾 1，李菁 1，杜少兵 1，周慧慧 1，王小平 ，白吉庆

（1.陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046；2.陕西省中药原料质量监测技术服务中心，陕西咸阳 712046）

黑豆在《神农本草经》中便以“生大豆”记载，具有益精明目、利水解毒的功效[1]。据文献报道，黑豆皮含有大量的花青素[2-3]、黄酮醇类化合物[4-6]，具有抗氧化[7-8]、预防心血管疾病、降血糖、保护视力[9-10]等作用。目前，黑豆皮总黄酮的提取优化工艺研究文献报道较少。超声波辅助提取技术能提高组分的溶出速度和效率，近年来在有效成分的提取工艺领域得到了广泛应用[11-12]；响应面法通过设计合理的试验方法，成为越来越多优化提取工艺的方法之一[13-15]。本研究采用超声波辅助提取工艺提取黑豆皮总黄酮，采用PlackettBurman优选提取因素后，再通过响应面法优化工艺，为黑豆皮的综合利用提供一定的参考。

1 材料与仪器

新鲜黑豆经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的种子，采于陕西省衡山县，经人工剥皮，干燥；芦丁对照品（10080-200707）购买于中国药品生物制品检定所；无水乙醇、NaNO₂、Al（NO3）3、NaOH均为分析纯。

UV-6100 DOUBLE BEAM紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；XSE105DualRange电子分析天平（瑞士赛多利斯集团；0.01 mg；0.1 mg）；LG-01高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；KQ-300VDE超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法

2.1 标准曲线的绘制

总黄酮测定参照文献[16-18]方法，取芦丁对照品，精密称定，加乙醇使溶解，定容25 mL，摇匀，制得0.185 6 mg/mL的芦丁对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL摇匀放置6 min；加入10%Al（NO3）3试液0.3 mL摇匀放置6 min；再加入4%NaOH溶液4 mL，并加入乙醇至刻度线，摇匀，放置15 min。用相应试剂作空白，在500 nm处测定吸光度，以浓度（X，mg/mL）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性方程Y=10.323X−0.003 8（r=0.999 6），表明芦丁的质量浓度在0.018 56～0.074 24 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 供试品溶液的制备

准确称取一定量的黑豆皮粉末（过60目筛），置于50 mL带塞玻璃瓶中，用移液管按照不同液料比加入不同体积分数的乙醇，称定质量，超声提取后取出静置，补足减失的质量，过滤，滤液放置备用。

2.3 总黄酮提取量的测定

精密吸取样品溶液0.5 mL置10 mL容量瓶，按“2.1”项的显色方法测定吸光度，根据以下公式计算黑豆皮总黄酮提取量：

式中：Y为吸光度，V为供试液体积（mL），W为样品质量（g）。

2.4 单因素试验设计

取黑豆皮粉末（过60目筛）0.2 g，精密称定，采用超声提取法，按照表1的因素水平进行单因素试验，分别考察乙醇体积分数（因素A）、超声功率（因素B）、液料比（因素C）、超声提取时间（因素D）、超声温度（因素E）对黑豆皮总黄酮提取量的影响。

表1 单因素试验水平表Table 1 Factors and levels

2.5 Plackett Burman试验设计

取黑豆皮粉末（过60目筛）0.2 g，精密称定，采用超声提取法，在单因素试验的基础上进行Plack‐ettBurman试验设计，按照表2的因素水平组合进行试验，选择对黑豆皮总黄酮有显著性影响的因素。

表2 Plackett Burman试验设计因素及水平Table 2 Plackett Burman Experimental design factors and levels

2.6 响应面试验设计

取黑豆皮粉末（过60目筛）0.2 g，精密称定，采用超声提取法，依据Plackett Burman试验结果，选取有显著性影响的因素再进行响应面试验设计，因素水平见表3。

表3 响应面设计因素水平表Table 3 Response surface design factor level table

2.7 工艺验证

取黑豆皮粉末（过60目筛）0.2 g，精密称定，加66倍量体积分数为67%的乙醇，超声处理（功率270 W），滤液按照“2.1”项方法测定总黄酮。

2.8 数据处理

采用Design-Expert 10.0.7 统计分析软件对试验数据进行分析，数据采用x±s的形式表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

由图1可见，总黄酮提取量随乙醇体积分数的增大而增大，在65%处达到最大值，因此选择乙醇体积分数为65%；液料比在50∶1时，总黄酮提取量达到最大值；超声功率变化幅度不大，在240 W处有最高值，选择超声功率为240 W；超声温度到达30℃后趋于平缓，在50℃略高，因此超声温度选择50℃；超声时间在20 min时，提取量达到最高值，30 min后反而降低，故超声时间选择20 min。

图1 各因素对黑豆皮总黄酮提取量的影响Figure 1 Effects of various factors on the extraction amount of total flavonoids from Glycine max coat

3.2 Plackett Burman试验结果

结果见表4、表5。

表4 Plackett Burman设计试验结果Table 4 Results of Plackett Burman Experimental design

由表5可见，回归方差模型具有显著性（P<0.05），对黑豆皮总黄酮提取的影响有统计学意义的因素是乙醇体积分数、超声功率和液料比（P<0.05）。

表5 Plackett Burman回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett Burman Regression model

3.3 响应面法试验结果

响应面的试验结果见表6，方差分析见表7。对表6的数据进行二次响应面回归拟合分析，得到编码回归方程为Y=62.21+4.18A+2.68B+10.01C−2.75AB+0.83AC+0.89BC−2.97A2+4.88B2−8.51C2。

表6 响应面设计试验结果Table 6 Results of Response surface design

由表7可见：模型极显著（P=0.008 1<0.01），失拟项不显著（P=0.685 4>0.05），说明模型合理；因素A乙醇体积分数（P=0.041 5<0.05）影响显著，因素C液料比（P=0.000 6<0.01）影响极显著，影响显著性顺序为C>A>B，二次项C2（P=0.007 9<0.01）影响极显著。

3.4 响应面交互作用分析

等高线的形状反应因素间的交互作用，等高线为椭圆形表明两者的交互作用显著[20，24]。依次固定乙醇体积分数、超声功率、液料比形成响应面图。等高线图呈椭圆形，3D图陡峭，表明交互作用越显著。从图2可以看出，在液料比方向的响应面曲线明显比乙醇体积分数、超声功率方向的曲线陡峭，说明液料比因素对响应值总黄酮提取量影响更加显著，这与表7结果一致。经Design-Expert 10.0.7 软件计算得到黑豆皮中总黄酮提取量的最佳工艺为：乙醇体积分数66.6%，超声功率270 W，液料比66.4∶1（mL∶g），预测值总黄酮提取量为73.59 mg/g。根据实际操作情况，设置乙醇体积分数、超声功率、液料比依次为67%、270 W、66∶1（mL∶g）。

图2 各因素交互作用对黑豆皮总黄酮提取量影响的曲面图与等高线图Figure 2 Surface profiles and contour maps of interaction of each factor affecting extraction amount of total flavonoids from Glycine max coat

表7 响应面试验结果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface design

3.5 验证试验

3批黑豆皮总黄酮提取量的平均值为（73.50±0.18）mg/g（n=3）与预测值（73.59 mg/g）非常接近，表明该模型合适有效。

4 讨论

本研究采用超声辅助提取黑豆皮总黄酮，相比回流提取更加方便简单，操作安全，适合于黑豆皮总黄酮的提取。同时，响应面法设计合理的试验，大大缩减了试验次数和时间，并通过回归方程寻求了最佳工艺参数，优化得到总黄酮提取量最佳工艺条件为乙醇体积分数67%，超声功率270 W，液料比66∶1，在此条件下，黑豆皮总黄酮提取量达到73.50 mg/g。

考察影响因素的试验过程中，Plackett Burman试验结果显示超声温度对总黄酮的含量影响不显著，原因可能与超声过程中仪器自身发热导致温度不恒定有关，同时本实验的黑豆皮经过人工剥取，原料难以获得，取样量较少，但相对之前黑豆皮总黄酮成分的提取工艺优化来讲，比溶剂提取法更简单有效，所含杂质更少，总黄酮的提取量提高了7～9倍。通过响应面法优化设计，表明模型合理，具有良好的重复性。本文对黑豆皮的研究，能更有效地提高药食两用黑豆的资源利用效率，为黑豆皮的开发与应用提供一定的基础。