2种内生和附生橡藻属绿藻的胞外分泌物研究

邓茹茹，马帅，谭德冠，付莉莉，张家明，孙雪飘，刘平怀

（1.海南大学化学工程与技术学院，海口 570228；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/中国热带农业科学院海南热带农业资源研究院/海南省热带微生物资源重点实验室，海口 571101）

微藻是一类古老的低等植物，其光合利用程度高，生长速度快，生物量大，且富含多种营养元素和活性物质，被广泛应用到多个领域。微藻在生长发育过程中会不断地向周围环境释放多种类型的代谢产物，如碳水化合物、有机酸、核苷酸、氨基酸、脂类、维生素、毒素等，这些产物统称为胞外分泌物[1]。微藻胞外分泌物不仅对微藻本身的生长发育、生理代谢、光合作用以及生态环境调节起重要作用[2-4]，有的还具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、净化水质等多种生物学功能[5-7]。例如：栅藻（Scenedesmussp.）的胞外分泌物对其自身的整个生长过程都有明显抑制，雨生红球藻（Haematococcus pluvislis）的胞外分泌物对其自身在稳定期后期有明显抑制[8]；铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的胞外酸性多糖具有抗肿瘤作用[9]，球等鞭金藻（Isochrysis galbana）的胞外多糖具有抗氧化活性[10]。因此，对微藻胞外分泌物的深入研究对微藻的高效培养、养殖环境调控以及其在医药保健、食品工业、农业养殖等领域的开发利用具有重要意义。

微藻种类繁多，分布广泛，在海洋、湖泊、陆地等各类环境中均有分布，其中以附生于植物树干表皮较为常见。而内生于高等植物细胞内部的微藻极为罕见，目前报道的仅有2 例，分别是TRÉMOUILLAUX-GUILLER 等在银杏细胞内部发现的一种胶球藻（Coccomyxa subellipsoidea）[11]和笔者所在的实验室人员从橡胶树细胞内部发现的海南橡藻（Heveochlorella hainanensis）[12]。本实验选取橡藻属2种绿藻，一种为内生的海南橡藻，另一种为附生于王棕树干表皮的王棕橡藻（Heveochlorella roystonensis）[13]，研究这2 种内生和附生的近源绿藻资源的代谢差异，对探究藻类进化规律具有重要意义。前期研究发现，海南橡藻和王棕橡藻虽然是同属的2个近源种，但生活方式差异明显。王棕橡藻可通过自养生长，但海南橡藻在缺乏外源有机碳源的条件下生长极为缓慢，虽然补充有机碳源能使海南橡藻快速生长发育，但培养后期培养液pH明显下降，藻细胞从逐渐凋亡至全部死亡。培养液成分的变化与微藻胞外分泌物密切相关。为深入探讨这2种不同生活方式的内生和附生橡藻属绿藻的胞外分泌物之间的差异，本研究通过测定这2种藻的生物量和培养液pH，并采用非靶向代谢物组学分析的方法对其胞外分泌物进行测定，以期从代谢物的角度分析不同生活方式的橡藻属藻种间的代谢差异，以及添加有机碳源对两者差异性的影响，旨在为海南橡藻培养条件的优化、其在适应性进化过程中的变化特征揭示和微藻胞外分泌物的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试藻株

实验所用藻株为本实验室从橡胶树细胞内部和王棕树干表皮分离获得，分别为海南橡藻（XJ）和王棕橡藻（A3-8），保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.1.2 培养条件

将2 种供试藻接种至Tris-乙酸盐-磷酸盐（Tris-acetate-phosphate,TAP）培养基和TAP＋0.5%蔗糖培养基（通过预实验发现，该质量分数最有利于海南橡藻的快速生长发育）中，并在24 ℃、光照条件下以150 r/min振荡培养。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290超高压液相色谱仪和Agilent 6545 QTOF 高分辨质谱仪（美国Agilent 科技公司）、ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.8 μm，美国Waters 公司）、HVE-50 高温高压灭菌锅（日本Hirayama 公司）、2-16K 台式冷冻离心机（德国Sigma 公司）、ATL-032LR 恒温培养箱（上海堪鑫仪器设备有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 胞外分泌代谢物的制备

分别配置细胞数量为1×106mL－1的海南橡藻、王棕橡藻悬液。将2种藻的悬液按10%的接种量分别接种于含0.5%蔗糖和无蔗糖的TAP 液体培养液中，在24 ℃、光照培养条件下以150 r/min振荡培养15 d（此时2种藻的生长到达平台期，海南橡藻开始出现凋亡现象）。培养液于4 ℃、5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，测量pH；并立即将上清液保存于－80 ℃超低温冰箱中。

1.3.2 待测样品的预处理

将待测样品于4 ℃条件下解冻后，取1 000 μL样品，加入4 000 μL体积比为1∶1的甲醇-乙腈溶液，涡旋60 s；于－20 ℃条件下沉淀60 min，4 ℃、1.7×104g离心15 min；取上清液，于35 ℃条件下真空抽干后，用200 μL体积比为1∶1的乙腈-水重新溶解，用0.22 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜过滤；取滤液100 μL，待上机，另取5 μL进行质量控制检测。

1.3.3 代谢物组学分析

将制备好的待测样品进行非靶向代谢物分析，测试条件如下：Agilent 6545A QTOF 高分辨质谱仪在控制软件下基于自动串联质谱（tandem mass spectrum,MS/MS）模式，进行一级、二级质谱数据采集，质量扫描范围（m/z）为50～1 100。分别采用正、负离子模式采集；柱温40 ℃，上样量1 μL。

1.3.4 统计分析

采用SPSS 17.0 软件对数据进行整理分析，并使用新复极差法（邓肯法）进行差异显著性检验。其中，P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有高度统计学意义。

2 结果与分析

2.1 有机碳源对海南橡藻与王棕橡藻生物量和培养液pH 的影响

由表1可见：采用TAP培养液培养15 d后，海南橡藻的生物量（按干质量计）仅为0.09 g/L，培养液pH由最初的6.93下降至6.63；王棕橡藻的生物量为3.20 g/L，培养液pH上升至7.43。添加0.5%蔗糖作为有机碳源时，王棕橡藻生物量增长了63.75%，达5.24 g/L，培养液pH 上升明显，达8.32；海南橡藻生物量显著增加，达3.87 g/L，培养液pH明显下降，为4.70。上述结果表明：不加有机碳源时，内生的海南橡藻生长极缓慢，而附生的王棕橡藻生长迅速；在生长过程中，海南橡藻产生的酸性胞外分泌物偏多，使培养液酸化，而王棕橡藻分泌的碱性代谢物偏多，使培养液碱化，即2 种藻培养液的pH 变化趋势相反。添加有机碳源时，2 种藻的生长速率均有显著提升，其中对海南橡藻生长繁殖的促进作用更好；同时，随着2种藻生物量的增加，培养液pH变化更为明显，王棕橡藻的培养液达弱碱性，海南橡藻的培养液达强酸性，藻细胞出现明显的凋亡现象。

2.2 海南橡藻与王棕橡藻的胞外分泌物种类分析

对2种藻的胞外分泌物进行测定，共检测到141种分泌物（表2），主要包括有机酸、核苷酸、氨基酸及其衍生物、糖类、酯类、胺类及生物碱、酮醇类等。其中：氨基酸及其衍生物的种类最多，共有35种，占总数的25%；胺类及生物碱次之，共有22种，占总数的17%；糖类最少，仅2种，占总数的1.42%。在2种藻的胞外分泌物中，海南橡藻拥有8 种特有的胞外分泌物，分别为羧酸、泛酸、5´-脱氧腺苷、N-乙酰-dl-蛋氨酸、脱氧核糖、氯苯吡胺、F-脒、L-硫代瓜氨酸二盐酸；王棕橡藻拥有6种特有的胞外分泌物，分别为香豆苷、苯丙氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸、组氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺、内酯二醇、右旋异黄烷。对比发现，在海南橡藻特有的胞外分泌物中酸性物质的种类较多。

表1 培养15 d后海南橡藻与王棕橡藻生物量和培养液pH的比较Table 1 Comparison of biomass and pH of culture media between H.hainangensis and H.roystonensis after 15 d

1）生物量按干质量计。同行数据后不同小写字母表示在P＜0.05水平差异有统计学意义。

1) Biomass is calculated by dry mass. The values within the same row followed by different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 probability level.

表2 海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物种类Table 2 Extracellular metabolite species of H.hainangensis and H.roystonensis

2.3 海南橡藻与王棕橡藻的胞外分泌物相对含量分析

从整体上看，海南橡藻与王棕橡藻的胞外分泌物中不同类型代谢物的相对含量占比较为相似。在不加有机碳源和添加0.5%蔗糖作为有机碳源的培养条件下，2 种藻的胞外分泌物中氨基酸及其衍生物的相对含量均为最高，胺类及生物碱次之，糖类最低（表3）。通过比较可以看出：不加有机碳源时，海南橡藻的有机酸相对含量占比是王棕橡藻的1.61 倍，胺类及生物碱相对含量占比是王棕橡藻的1.22 倍，而王棕橡藻的核苷酸相对含量占比明显高于海南橡藻，为其2.30 倍。添加有机碳源后，海南橡藻糖类、酯类占比显著上升，分别增加了73.33%、71.58%，而王棕橡藻糖类占比无变化，脂类占比仅上升15.78%；王棕橡藻和海南橡藻酮醇类占比均有所下降，分别降低了26.91%和32.37%；王棕橡藻胞外分泌物中核苷酸相对含量占比几乎没有变化，而海南橡藻胞外分泌物中核苷酸相对含量占比增长得最多，增加了175.86%，增加后占比反而高于王棕橡藻；王棕橡藻胞外分泌物中有机酸相对含量占比有所下降，降低了44.61%，而海南橡藻有机酸相对含量占比反而明显上升，增加了41.46%，增加后海南橡藻有机酸相对含量是王棕橡藻的4.11倍；王棕橡藻胺类及生物碱相对含量占比略微上升，而海南橡藻的反而略微下降。

表3 海南橡藻与王棕橡藻胞外分泌物各种类占比Table 3 Proportion of extracellular metabolite types isolated from the culture media of H.hainangensis and H.roystonensis %

2.4 海南橡藻与王棕橡藻胞外分泌物中有机酸组成分析

如表4所示，在2种培养条件下，从海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物中共检测到12 种有机酸。其中：不加有机碳源时，王棕橡藻被检测到8 种有机酸；添加有机碳源后，增加了乙酰乙酸和甲基乙烯酸。不加有机碳源时，海南橡藻被检测到10种有机酸；添加有机碳源后，增加了泛酸和甲基乙烯酸。整体上看，海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物中有机酸组成有一定的相似性，两者拥有10 种共有成分，但各种有机酸相对含量在总有机酸中的占比差异较大；同时，有机碳源的添加对两者有机酸成分的组成和相对占比均有较大影响。

通过比较发现：海南橡藻中维生素A 酸相对含量在总有机酸中的占比最高，不加有机碳源时占比为31.64%，添加有机碳源后高达61.73%。王棕橡藻在不加有机碳源时，3，4，5-三甲氧基肉桂酸相对含量在总有机酸中的占比最高，达46.42%；添加有机碳源后维生素A 酸占比最高，为23.59%。添加有机碳源后，2 种藻胞外分泌的有机酸中硅酸、维生素A 酸以及甲基乙烯酸3 种酸性物质占比均有所提升，其中甲基乙烯酸均为从无到有；两者维生素A 酸的增幅均为最大，海南橡藻由31.64%增至61.73%，王棕橡藻由5.41%增至23.59%。添加有机碳源后，2 种藻胞外分泌的有机酸中有3 种占比均下降，分别为N-羧乙基-γ-氨基丁酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、11，14-反式二十碳二烯酸。此外，添加有机碳源后，海南橡藻胞外分泌的有机酸中乙酰乙酸、5-氨基乙酰丙酸、2-氨基十六酸、甲基戊酸等4 种有机酸占比下降，而王棕橡藻反而上升。

表4 海南橡藻和王棕橡藻胞外分泌物中有机酸组分占总有机酸的比例Table 4 Proportion of organic acids to total organic acids of extracellular metabolites isolated from the culture media of H.hainangensis and H.roystonensis%

3 讨论

在2 种内生和附生橡藻属绿藻中，附生的王棕橡藻在培养过程中培养液pH 升高，与大多数自养型微藻培养液pH 变化一致。例如，赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense） 和 中 肋 骨 条 藻（Skeletonema costatum）在生长过程中培养液pH 均呈现上升的现象[14-15]；蓝藻（Cyanobacteria）水华会导致水体pH上升[16]；小球藻（Chlorella vulgaris）、铜绿微囊藻、斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）在生长过程中均能使水环境pH上升[17-18]。前人研究表明，自养型微藻在光合作用过程中，可通过碳酸酐酶产生OH－，并分泌到细胞外，从而调节细胞培养液的pH[19]，使之更适宜于藻细胞的生长。而内生的海南橡藻在培养过程中培养液逐渐酸化，在增加有机碳源后，酸化程度增强，导致藻细胞凋亡。这种培养液酸化的现象与大多数自养型微藻相反，该差异可能与海南橡藻在进化过程中，长期的内生环境导致与光合作用相关的基因丢失、不表达或者是产酸的相关代谢通路发生改变有一定关系。

2种内生和附生橡藻属绿藻的胞外分泌物种类繁多，其中，氨基酸及其衍生物种类最多，其次是胺类和生物碱。氨基酸及其衍生物在生命体的新陈代谢中发挥重要作用，同时，还可作为饲料和食品添加剂，具有广阔的市场应用前景。2 种藻胞外能分泌大量氨基酸及其衍生物，表明其有可能作为细胞工厂来实现多种氨基酸及其衍生物的生物合成[20]。胺类及生物碱也是生物体内重要的生理活性物质，具有抗病、抗逆等作用。2种橡藻属绿藻胞外分泌了22种胺类及生物碱，其中一些具有良好的应用价值，例如，1-脱氧野尻霉素具有降糖、抗病毒和抗肿瘤等功效[21]。同时，从2 种绿藻中检测出的12种有机酸具有广泛的生物学活性[22]，其中，维生素A酸是维生素A的中间代谢产物，在调节和控制细胞增殖、生长发育等环节发挥重要作用；而5-氨基乙酰丙酸则是生物体内吡咯生物合成途径的关键中间产物[23]，也是诸如叶绿素、血红素、维生素B12等四吡咯的前体，可作为能降解的杀虫剂，也可被用作植物生长促进因子[24]。总之，对2 种内生和附生橡藻属绿藻胞外分泌物的鉴定，发现了一批具有潜在开发利用价值的分泌物，这为2 种藻的开发利用奠定了基础。

比较2种藻胞外分泌物中各类型代谢物相对含量占比发现，差异较为明显的主要是核苷酸和有机酸。在核苷酸方面，不加有机碳源时，海南橡藻胞外分泌物中核苷酸相对含量占比低于王棕橡藻，这与自养条件下海南橡藻生长缓慢、生物量极少有关；而添加有机碳源后，海南橡藻核苷酸占比大幅增加，增加后反而高于王棕橡藻，这可能与补充有机碳源后，海南橡藻快速生长并在后期因培养液酸化大量凋亡解体有一定关系。在有机酸方面，不加有机碳源时，2 种藻的有机酸相对含量占比相差仅0.61 倍。添加有机碳源后，海南橡藻有机酸占比增加，王棕橡藻反而降低，两者相差达3.11倍，该变化差异与2种藻培养液酸碱变化的差异一致。通过比较发现，海南橡藻拥有羧酸和泛酸2 种特有的有机酸。其中：羧酸是三羧酸循环中间代谢产物，对藻在一定程度上有杀灭和抑制作用[25]，海南橡藻生长缓慢可能与其分泌的羧酸对自身细胞的抑制作用存在一定的关系。泛酸是辅酶A 和酰基载体蛋白生物合成的重要前体物质，参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢[26-27]；泛酸在脂肪酸代谢中有重要作用，对脂肪酸的合成具有促进效果[28]。前期研究发现，添加有机碳源后，海南橡藻油脂含量明显升高，这可能与其在有机碳源的促进下，产生大量泛酸有一定的关系。此外，不同于自养型绿藻，海南橡藻在培养过程中出现培养液酸化的现象，可能是其适应内生环境过程中的一种自我抑制现象。海南橡藻可能通过分泌羧酸等酸性物质，调控外界环境和自身生长繁殖，以控制其内生于宿主中的数量。该特异现象的产生可能与海南橡藻在长期内生过程中相关代谢途径发生了适应性进化有一定的关系。

4 结语

本文对2种内生和附生橡藻属绿藻在培养过程中生物量、培养液pH 以及胞外分泌物进行研究表明：在培养过程中海南橡藻培养液呈酸性变化，王棕橡藻的呈碱性变化；不加有机碳源时，海南橡藻生长极为缓慢，王棕橡藻可以正常生长；添加有机碳源能明显促进2 种藻的生长繁殖，其中对海南橡藻的促进作用尤为明显。同时，添加有机碳源会加剧2种藻培养液酸碱化的变化程度，其中，海南橡藻培养液达强酸性，使其自身逐渐凋亡。2 种藻的胞外分泌物共有141种，种类丰富多样，两者共有的种类有127 种；在特有种类中，海南橡藻有8 种，王棕橡藻有6种，其中，海南橡藻有羧酸和泛酸2种特有的有机酸。2 种藻胞外分泌物中有机酸、核苷酸的相对含量占比差异较为明显。添加有机碳源能明显促进海南橡藻有机酸的分泌，抑制王棕橡藻有机酸的分泌，使得两者培养液酸碱性变化的差异性更为显著。

微藻胞外分泌物复杂多样，但相关研究相对较少，而非靶向代谢组学的分析运用，可增加微藻胞外分泌物的覆盖范围，为研究藻类对外界的响应提供了广阔前景。本文从培养液酸碱性变化及藻胞外分泌物组分分析的角度开展研究，为进一步研究橡藻属附生/内生藻种适应性进化，发掘具有特殊活性、高开发价值的微藻胞外分泌物提供了一定的实验依据。