AD7c-NTP定量检测试剂盒的性能验证及评价

汪光蓉，卢小岚，杜琴，姚丽华，李淑云，王强

(川北医学院，1.附属医院检验科；2.医学检验系；3.转化医学研究中心,四川 南充 637000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD )又称老年性痴呆，目前世界范围内已超过2600万，预计到2050年将超过1亿600万，为当今全球的重大公共卫生问题[1-2]。但由于该病病因非常复杂，且缺乏有效的治疗手段[3]，因此在其发展成轻度症状之前及时给予神经保护药物或进行生活方式的干预非常关键[4]。早发现、早诊断，以争取更多治疗或干预的时间对于延缓病情进展显得十分重要。

阿尔茨海默病相关神经丝蛋白(alzheimer-associated neuronalthread protein,AD7c-NTP)于1997年首次在晚期 AD 患者的颞叶脑组织中用抗胰腺丝蛋白抗体分离并命名，是一种分子量为 41 kD 的跨膜磷蛋白，主要在神经元中表达[5]。有研究[6]表明，AD7c-NTP 在AD发病过程中扮演了重要角色，与 AD 病理表现关系密切，在AD患者脑组织、脑脊液、尿液中均可检测出其水平升高，并且升高程度与病情严重程度具有相关性。因此，AD7c-NTP可以作为AD早期诊断的重要生物标志物之一[7]。

准确、简便的检测人尿液中 AD7c-NTP水平，对早期筛查AD并及时给予药物及生活方式干预，延缓病程进展，减轻社会及家庭负担，有非常重要的意义。本研究依据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 批准的EP15-A2[8]、EP6-A[9]及C28-A3[10]文件，对深圳市安群生物工程有限公司研制的AD7c-NTP ELISA定量测定试剂盒进行精密度、准确度、检测灵敏度、线性范围和生物学参考范围等5个主要分析性能的验证，为该试剂盒在临床实验室的应用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年6月至2020年6月川北医学院附属医院AD患者的小便标本9例，检测AD7c-NTP水平，筛选出阳性高值及低值，用于实验及制备高低值混合标本；另收集健康体检人群小便样本20份。试剂 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒由深圳市安群生物工程有限公司研发并提供；Phomo全自动酶标仪购自郑州安图生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 精密度验证 (1)批内精密度验证：同一批号20200605试剂，定标1次。取高、低浓度混合小便样本，连续测定10次，计算均值(M)、标准差(SD)、变异系数CV(<15%为合格)；(2)批间精密度验证：每天1批试剂，每批测定2个样本，每个样本复检5次，连续检测4次。计算M、SD、CV(<20%为合格)。结果判定时，若质控品失控，则当次数据无效，当>4SD的离群值个数大于>1时，应考虑试验方法的稳定性或操作问题。

1.2.2 准确度验证 将阳性质控品测定5 d，每天重复两次，计算阳性质控品测定结果M、SD、CV(<15%为合格)。

1.2.3 分析灵敏度验证 用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，计算吸光度值(A)、M和SD，得出M+2SD所对应的A值。根据试剂盒所用校准品的校准曲线方程，将M+2SD所对应的A值代入，求出所对应浓度值，即为最低检测限，结果应符合性能指标要求(<0.25ng/mL)。

1.2.4 线性范围验证 样本要求与待检样本基质一样，取高、低浓度小便样品，按 4 L、3 L+1 H、2 L+2 H、1 L+3 H、4 H的比例配制成5个浓度样本，浓度覆盖已知最低和最高限。每个浓度测定3次，1 d内完成。分别计算每个样本检测结果的M，排除离群值，用线性检验Y=a+bX计算相关系数，预期值与测量值相关系数应>0.98。

1.2.5 生物参考范围验证 对收集的 20 份健康成人小便样本进行检测，并根据美国 CLSI 批准的 C28-A3682文件方法进行分析，检测结果均在试剂说明书提供的参考区间内或仅有1个标本超出。

2 结果

2.1 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的精密度

高、低两个浓度混合小便样本批内 CV 分别为9.50 %和4.99%；批间 CV 分别为10.89%和13.54%， 均小于15%。见表1。

表1 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的精密度

2.2 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的准确度

AD7c-NTP阳性质控品5次检查的均值CQC为6.512 ng/mL，均在6 ng/mL偏差±15%范围内。见表2。

表2 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的准确度(n=5)

2.3 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的分析灵敏度

校准品A重复检测20次，浓度(C)均值CA+2SD=0.086 ng/mL≤0.25 ng/mL； OD值均值ODA+2SD=0.013，代入标准曲线中对应的浓度值为0.087 ng/mL≤0.25 ng/mL。见表3。

表3 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的分析灵敏度(n=20)

2.4 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的线性范围

预期值(L)C：0.20 ng/mL，预期值(H)C：9.62 ng/mL。由L/H计算其他C值：3 L+1 H：2.55 ng/mL； 2 L+2 H：4.91 ng/mL；1 L+3 H：7.26 ng/mL，将其作为预期C值。5个样本重复检测3次， 实测值M分别为0.20、2.99、5.50、7.71和9.62 ng/mL。以实测值为纵坐标、预测值为横坐标进行相关回归分析，得到回归方程y =1.041x。线性范围为0.20～9.62 ng/mL，预期值与实测值的相关系数r>0.98。见图 1。

2.5 AD7c-NTP ELISA定量检测试剂盒的生物参考范围

20份健康人尿样检测值范围为0.07～0.92 ng/mL，均在AD7C-NTP说明书生物参考范围0～1.5 ng/mL内，满足不超过2例检测值不在参考范围内。见图2。

3 讨论

AD诊断中最具特异性的生物标记物是脑脊液β-淀粉样蛋白类(Aβ42) 和tau 蛋白(总tau 蛋白和磷酸化tau蛋白)[11]。但由于标本获取为有创的脑脊液，患者普遍不能接受而临床应用受限。有研究[12]证实，AD7c-NTP作为一种新的AD生物学标志物，在尿中的表达水平对早期诊断和病情评估具有重要的参考价值，而且尿AD7c-NTP诊断 AD 的灵敏度和特异度与脑脊液差别不大[13]，直接以尿液为标本进行检测能为多数患者接受。

目前，AD7c-NTP的检测主要为ELLSA双抗体夹心法。本次评价的AD7c-NTP ELLSA定量检测试剂盒为改良双抗体夹心法，可以根据已知浓度的校准品绘制出标准曲线，最终算出样本的AD7c-NTP 含量。但这种通过ELLSA定量检测的结果，不同于临床化学定量分析的特点。因此，非常有必要对试剂盒本身进行精密度、准确度、检测灵敏度、 线性范围及生物参考范围等性能指标的验证。

本实验对AD7c-NTP ELLSA定量检测试剂盒验证结果表明，低、高值尿样标本检测批内CV分别为4.99%和9.50%；批间分别为10.89%和13.54%，均小于15%，表明试剂盒精密度较好。试剂盒的准确度方面，一般用反映不准确度的偏差和偏差系数来表示。AD7c-NTP阳性质控品5次检测的均值CQC为6.512 ng/mL，均在6 ng/mL偏差±15%范围内，表明准确度较好。采用试剂盒中的低值校准品重复检测，算出检测浓度均值或OD均值代入标准曲线中得到对应的浓度值分别为0.086 ng/mL和0.087 ng/mL，均小于试剂盒本身规定的0.25 ng/mL，表明分析灵敏度较好。采用L(低值)～H(高值阳性尿液)进行重复检测，拟合计算出样本预期值与实测值的相关系数r为0.996，大于试剂盒要求的0.98，表明线性较好。20例健康人群尿液检测值介于0.07～0.92ng/mL，均在说明书生物参考范围0～1.5 ng/mL。

综上所述，深圳安群生物工程有限公司研发生产的AD7c-NTP ELLSA定量检测试剂盒的精密度、准确度、分析灵敏度、线性范围及生物学参考区间经方法学验证，产品性能符合要求。该试剂盒有检测结果准确可靠，重复性好，变异系数小，线性范围较宽等优点，可能为AD的早期诊断和病情评估提供快速便捷、可操作性强、无侵入性的重要生物学标记物检测手段。但由于标本获取受限，本实验尚存在一些不足，如对阳性样本的验证偏少、欠缺对处于医学决定水平的样本验证、未对浓度梯度的标本进行验证等。而且，关于AD7c-NTP在AD 发病过程中产生表达的具体机制研究还不明确，该试剂盒对于AD早期诊断和病情评估价值的探讨尚缺乏大样本多中心数据支持，有待后续的进一步研究。