龙胆苦苷对人卵巢癌细胞株A2780/DDP顺铂化疗敏感性的影响及机制探讨*

井晶，刘梦，郭静，田二斌

郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450003

卵巢癌是一种高度异质类肿瘤，其发病率位于女性恶性肿瘤第2位，而致死率在女性恶性肿瘤中位居首位［1］。卵巢癌早期无明显痛感和典型症状，不易察觉，因此确诊时往往已为中晚期，癌细胞已转移到腹腔，严重威胁女性健康［2］。化疗技术是中晚期肿瘤治疗的主要手段，以铂类药物为基础的化疗方法在卵巢癌的治疗中普遍使用［3］。虽然该方法可提高患者5年生存率，但是由于卵巢癌复发率高、易耐药，使得治疗效果不明显［4］。据报道，90%的卵巢癌晚期患者因多药耐药死亡［5］。研究表明，初次化疗患者中至少存在20%的患者对铂类化疗药物具有耐药性，而在卵巢癌复发患者中，对该药的耐药率高达70%以上［6］。因此，如何降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是目前研究的热点和难点。龙胆苦苷提取自龙胆科植物龙胆，具有抗炎镇痛、保肝利胆、健胃等功效［7］。研究表明，龙胆苦苷还有抗肿瘤的作用，可抑制卵巢癌细胞增殖、凋亡和迁移［8］。但是该药物对耐顺铂卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的影响尚未涉及，因此，本研究使用龙胆苦苷处理人卵巢癌细胞株A2780/DDP，研究其对顺铂化疗敏感性的影响，并探讨其机制，为龙胆苦苷在临床卵巢癌治疗中的应用提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞人卵巢癌细胞株A2780/DDP（上海美轩生物科技有限公司，货号C1015112），-80℃恒温保存，避免反复冻融。

1.2 药物与试剂顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，批号：181204）；龙胆苦苷（成都德思特生物技术有限公司，纯度≥98%，批号：1808006）。RAMI 1640培养基（美国Gibco公司，批号：20181046）；MTT法细胞增殖分析试剂盒（美国Trevigen公司，批号：1811102）；吉姆萨染色试剂盒（上海歌凡生物科技有限公司，批号：20181016003）；二甲基亚砜（苏州联雄化工科技有限公司，批号：20190516）；4%多聚甲醛（上海远慕生物科技有限公司，批号：201904112）；RNA提取试剂盒（美国赛默飞公司，批号：1904125）；蛋白提取试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司，批号：P1903147）；反转录试剂盒（日本Takara公司，批号：190415）；RT-qPCR染色试剂盒（常州百代生物科技有限公司，批号：1902183）；Bcl-2、p53、XIAP、Survivin、p-p53、β-actin一抗和二抗（美国Aviva Systems Biology公司，批号：1904126、1904166、1901118、1904187、1902137、1906132、1905157、1907157、1906128、1908142、1905119、1907135）；TUNEL凋亡检测试剂盒（北京索莱宝公司，批号：20181203）；BCA蛋白定量检测试剂盒（美国Sigma公司，批号：20190812004）；引物合成委托上海赛百盛基因技术有限公司。

1.3 仪器MCO-18AC CO2细胞培养箱（日本SANYO公司）；ELX808酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；Q1000 RT-qPCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；DY-1000C蛋白电泳设备（南京贝帝试验仪器有限公司）；CX31型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；CKX53倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；BD-YG500荧光显微镜（广州博视达光学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养、分组和干预人卵巢癌细胞株A2780/DDP使用RAMI 1640培养基置于5%CO237℃恒温细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数期，每孔1×105个细胞加入96孔板中，分为对照组、顺铂组、龙胆苦苷组、顺铂+龙胆苦苷组，每组设置6个重复。顺铂组加入5 mg·L-1顺铂，龙胆苦苷组加入15μmol·L-1龙胆苦苷，顺铂+龙胆苦苷组加入15μmol·L-1龙胆苦苷和5 mg·L-1顺铂，对照组给予等体积生理盐水，培养48 h。

2.2 细胞形态学观察药物干预24 h后，将细胞置于光学显微镜下观察细胞形态。

2.3 细胞增殖抑制率检测分别于药物干预24 h和48 h后使用MTT法检测细胞增殖抑制率。每孔加入20μL MTT溶液，置于细胞培养箱中培养4 h后，弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜，避光震荡10 min，使用酶标仪读取490 nm处光吸收值。

细胞增殖抑制率＝（1-OD实验组/OD对照组）×100%。

2.4 细胞凋亡指数检测药物干预48 h后，按照TUNEL试剂盒说明书检测细胞凋亡指数。弃去细胞培养基，使用4%多聚甲醛固定细胞2 h，移去固定液，PBS洗3遍，按照TUNEL试剂盒说明书操作加入试剂，用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下随机观察5个视野中凋亡阳性细胞个数，计算细胞凋亡指数。

细胞凋亡指数＝（细胞凋亡数/细胞总数）×100%

2.5Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相对表达量检测采用RT-qPCR检测Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相对表达量。药物干预48 h后，收集细胞至离心管中，加入Trizol试剂，按照RNA提取试剂盒说明书进行细胞总RNA提取，使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。从NCBI基因库中查找目的基因mRNA序列并设计出目的基因上下游引物，引物序列见表1。反应条件为：94℃5 min，94℃1 min，56℃30 s，72℃40 s，最后55℃停止。通过配套荧光信号采集系统分析样品CT值并以β-actin为内参计算各样品mRNA相对表达量。

表1 引物序列

2.6 Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表达水平及p53磷酸化水平检测采用Western blot检测Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表达水平及p53的磷酸化水平。药物干预48 h后，收集细胞于离心管中，通过蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒进行蛋白定量。取40μL样品上样，蛋白电泳，转膜后加封闭液孵育，加一抗（1∶1 000）孵育，加二抗（1∶2 000）孵育，ECL化学发光试剂盒曝光、显色，扫描成像，以β-actin图像灰度值为对照，计算各组蛋白相对表达量。

2.7 统计学方法统计结果用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 22.0对实验数据进行统计学分析。使用单因素方差分析对多组间数据进行比较，使用SNK-q检验对数据进行两两比较，使用t检验对组内数据进行比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 龙胆苦苷对A2780/DDP细胞形态的影响对照组A2780/DDP细胞生长状态良好，细胞排列呈现铺路石状，细胞连接紧密且轮廓清晰，偶见死亡悬浮细胞；顺铂组可见少量死亡悬浮细胞，细胞间隙变大，偶见细胞核碎裂；龙胆苦苷组可见部分死亡悬浮细胞，细胞核碎裂较多；顺铂+龙胆苦苷组可见较多细胞处于死亡悬浮状态，细胞核碎裂严重。见图1。

图1 A2780/DDP细胞形态学观察（×200）

3.2 龙胆苦苷对A2780/DDP细胞增殖抑制率的影响与对照组比较，药物干预24h后，各给药组A2780/DDP细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.05）；药物干预48后，各给药组A2780/DDP细胞增殖抑制率显著升高，且高于24 h时同组的细胞增殖抑制率（P＜0.05）。药物干预24 h和48 h后，各组增殖抑制率两两比较均表现出：顺铂+龙胆苦苷组＞龙胆苦苷组＞顺铂组＞对照组，且各组间比较均有显著差异（P＜0.05）。结果见表2。

表2 A2780/DDP细胞增殖抑制率比较 （±s，%）

表2 A2780/DDP细胞增殖抑制率比较 （±s，%）

注：与同组24 h比较，*P＜0.05；与同期对照组比较，a P＜0.05；与同期顺铂+龙胆苦苷组比较，b P＜0.05；与同期龙胆苦苷组比较，c P＜0.05

24 h 48 h对照组组别 n 6 0 0顺铂组 6 19.74±1.28abc 22.15±3.34*abc龙胆苦苷组 6 28.81±2.37ab 31.37±2.66*ab顺铂+龙胆苦苷组 6 34.12±3.84a 45.14±4.90*a

3.3 龙胆苦苷对A2780/DDP细胞凋亡指数的影响采用TUNEL法考察药物干预48 h后，龙胆苦苷对A2780/DDP细胞凋亡指数的影响。与对照组比较，药物干预48 h后，A2780/DDP细胞凋亡指数显著升高（P＜0.05），且顺铂+龙胆苦苷组＞龙胆苦苷组＞顺铂组＞对照组，各组间比较均有显著差异（P＜0.05）。结果见图2，表3。

图2 TUNEL检测A2780/DDP细胞凋亡（×100）

表3 A2780/DDP细胞凋亡指数（±s，%）

表3 A2780/DDP细胞凋亡指数（±s，%）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与顺铂+龙胆苦苷组比较，b P＜0.05；与龙胆苦苷组比较，c P＜0.05

组别 n 细胞凋亡指数对照组5.06±0.52顺铂组 6 19.33±2.38abc龙胆苦苷组 6 36.40±5.31ab顺铂+龙胆苦苷组 6 65.27±10.55 6 a

3.4 龙胆苦苷对A2780/DDP细胞Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA表达的影响与对照组比较，p53 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），且顺铂+龙胆苦苷组＞龙胆苦苷组＞顺铂组＞对照组，各组间比较均有显著差异（P＜0.05）；Bcl-2、XIAP和Survivin的mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），且对照组＞顺铂组＞龙胆苦苷组＞顺铂+龙胆苦苷组，各组间比较均有显著差异（P＜0.05）。结果见表4。

表4 A2780/DDP细胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相对表达量 （±s）

表4 A2780/DDP细胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相对表达量 （±s）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与顺铂+龙胆苦苷组比较，b P＜0.05；与龙胆苦苷组比较，c P＜0.05

mRNA对照组组别 n Bcl-2 mRNA p53 mRNA XIAP mRNA Survivin 6 1.13±0.12 0.74±0.10 0.85±0.14 1.01±0.11顺铂组 6 0.81±0.09abc 1.05±0.12abc 0.64±0.08abc 0.87±0.09abc龙胆苦苷组 6 0.67±0.08ab 1.43±0.11ab 0.49±0.08ab 0.62±0.10ab顺铂+龙胆苦苷组 6 0.55±0.07a 1.79±0.15a 0.33±0.07a 0.45±0.07 a

3.5 龙胆苦苷对A2780/DDP细胞Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表达水平及p53磷酸化水平的影响与对照组比较，p53蛋白表达量和磷酸化水平显著升高（P＜0.05），且顺铂+龙胆苦苷组＞龙胆苦苷组＞顺铂组＞对照组，各组间比较均有显著差异（P＜0.05）；Bcl-2、XIAP和Survivin蛋白表达量显著降低（P＜0.05），且对照组＞顺铂组＞龙胆苦苷组＞顺铂+龙胆苦苷组，各组间比较均有显著差异（P＜0.05）。见图3，图4。

图3 A2780/DDP细胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表达水平及p53磷酸化水平

图4 A2780/DDP细胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白相对表达水平及p53磷酸化水平

4 讨论

随着我国老龄化日益严重，卵巢癌的发病率也逐渐提高［9］。卵巢位于盆腔内，位置隐蔽，发病早期无明显症状，又尚无早期特异性诊断标志物，因此早期难以诊断［10］。未生育、高脂饮食等都是诱发该病的危险因素［11］。目前，化疗是中晚期卵巢癌患者治疗的重要手段，以顺铂为主的第一代化疗药物具有广谱抗癌、杀伤力强的特点，广泛运用于恶性肿瘤的临床治疗［12］。顺铂进入细胞，通过与细胞核中DNA结合从而抑制其转录和复制过程，最终诱导细胞凋亡［13］。但是，长期使用顺铂会使肿瘤细胞产生耐药性，药效大打折扣。卵巢癌细胞对顺铂的耐药机制具有多种途径，阻碍顺铂与DNA结合、干扰细胞凋亡等都是其产生耐药性的可能机制［14］。因此，寻找加强耐药细胞对顺铂敏感性的方法，是解决肿瘤细胞耐药问题的关键所在。

龙胆为我国传统中草药，具有泻肝胆火、除下焦湿热的功效，龙胆苦苷为其主要成分，除保肝利胆，还有抗菌、消炎、止痛、抗肿瘤等功效［15］。研究表明，龙胆苦苷可诱导人肝癌细胞、卵巢癌细胞凋亡［16-17］。本研究使用龙胆苦苷和顺铂作用于对顺铂耐药的A2780/DDP细胞，24 h后细胞出现了不同程度的形态学改变，其中龙胆苦苷和顺铂联合用药组A2780/DDP细胞形态改变最严重。细胞增殖抑制率实验证明，龙胆苦苷可抑制A2780/DDP细胞增殖，并且顺铂+龙胆苦苷组A2780/DDP细胞增殖抑制效果最佳。TUNEL实验结果再次证实，龙胆苦苷可显著促进A2780/DDP细胞凋亡，其中顺铂+龙胆苦苷组细胞凋亡指数显著高于其余各组，表明龙胆苦苷可抑制A2780/DDP细胞增殖，促进细胞凋亡，增强耐药细胞株A2780/DDP的顺铂敏感性。

顺铂可诱导肿瘤细胞凋亡，但其作用机制尚未完全明确。目前，已知p53、Bcl-2蛋白在顺铂诱导的细胞凋亡中起重要作用［18］。p53为肿瘤抑制蛋白，研究表明，p53基因的激活可诱导肿瘤细胞的凋亡，也是顺铂诱导细胞凋亡的关键所在，p53磷酸化水平与其稳定、激活有直接关系［19］。顺铂可激活p53，诱导p53磷酸化，从而发挥其诱导细胞凋亡的功能，而p53基因突变可使卵巢癌细胞株对顺铂的敏感性下降，诱导顺铂耐药［20］，因此，激活p53是提高顺铂化疗敏感性的重要环节。Bcl-2家族蛋白位于线粒体中，对细胞凋亡具有调控作用，其中Bcl-2具有抑制凋亡作用，Bcl-2的过表达可导致细胞存活延长，凋亡抑制［21］。研究表明，顺铂耐药肿瘤细胞中可观察到Bcl-2的过表达，而降低Bcl-2表达水平可提高顺铂化疗敏感性［22］。XIAP和Survivin属于凋亡抑制蛋白，对细胞周期、信号传导、细胞凋亡均有调节作用。凋亡抑制蛋白可以通过阻碍细胞凋亡，促进肿瘤细胞的耐药性［23］。XIAP的过表达可导致存活因子如caspase-3、caspase-7、caspase-9等蛋白磷酸化并失活，从而阻断顺铂诱导细胞凋亡。研究表明，顺铂可以抑制敏感细胞株中XIAP蛋白的表达并诱导caspase-3和caspase-9活化，引起细胞凋亡，而耐药细胞株中XIAP蛋白高表达则细胞对顺铂化疗敏感性降低［24］，因此，抑制XIAP基因和蛋白表达可增加癌细胞对顺铂化疗的敏感性。Survivin在恶性肿瘤中存在过表达，而正常细胞中表达量极低。研究表明，向人卵巢癌细胞中转染Survivin基因，诱导Survivin表达量升高，可导致其顺铂耐药性显著增加，化疗敏感性显著降低［25］。本 研 究 对A2780/DDP细 胞 株 中p53、Bcl-2、XIAP、Survivin的表达量进行检测，结果显示，p53 mRNA和蛋白及其磷酸化水平表达增加而Bcl-2、XIAP、Survivin的mRNA和蛋白表达量均降低，表明龙胆苦苷可通过上调p53表达水平和磷酸化水平，下调Bcl-2、XIAP和Survivin表达水平，增强A2780/DDP细胞株顺铂敏感性，促进A2780/DDP细胞凋亡。

综上所述，龙胆苦苷可抑制细胞株A2780/DDP增殖、促进肿瘤细胞变形、凋亡，且可增强耐顺铂A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性，推测其机制是通过上调p53表达水平及磷酸化水平，下调Bcl-2、XIAP和Survivin表达水平。本研究结果对克服卵巢癌顺铂耐药性具有临床意义，但是龙胆苦苷对正常细胞是否具有细胞毒性尚未讨论，其临床应用可行性也尚未涉及，因此有待后续深入研究。