miR-146a在三阴乳腺癌中的表达及意义

翟云芝，张浩然，石默晗

(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科，安徽 蚌埠 233004)

目前，乳腺癌作为对女性危害最大的恶性肿瘤问题，严重影响了女性健康[1]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是较为特殊的乳腺癌亚型，代表相应的雌激素(estrogen receptor，ER)、孕激素(progesterone receptor，PR)与人表皮生长因子(human epidermal growth factor receptor，HER-2)三类受体都表现为阴性，这一特殊亚型由于缺乏治疗靶点，治疗手段单一，又非常容易出现复发及内脏转移，目前5年生存率不足30%[2]。TNBC目前在治疗上以化疗为主，缺少更多其他有效的治疗措施。因此，TNBC在治疗方面迫切需要寻求新的治疗靶点，以提高TNBC的治疗效果[3]。而微小RNA(miRNA)是近年肿瘤研究的热点，其在真核细胞的基因表达、细胞分化等方面发挥着重要的调控作用。miRNA作为转录长度为18～22 个核苷酸的非编码RNA，依靠和靶基因3′UTR的结合，进一步实现控制mRNA的效果，在很多肿瘤的进展过程中都有重大的影响[4]。miR-146a是miRNAs家族非常重要的成员，对于恶性肿瘤的产生、进展有非常关键的调控作用，该部分的实际表达和恶性肿瘤的进展与侵袭等存在紧密联系，相关报道得出miR-146a在胃癌、肺癌等肿瘤的实际表达有明显下调，miR-146a下调有助于调节癌变部分的增殖[5]。但是通过分析与追踪学术领域的最新研究课题，对TNBC的miR-146a表达和临床病理间的联系，少见有报道。通过对miRNA基因库开展筛查，即可发现miR-146a或许和乳腺癌存在联系，或许有调控增殖与加速血管生成的效果。所以，对此我们运用实时荧光定量PCR法，进一步测定miR-146a的具体指标，判断该指标和细胞增殖的联系，对更为深入的研究TNBC机制与进展问题，提供更加可靠的数据与理论支持。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选定2015年1月—2015年11月蚌埠医学院第一附属医院60例TNBC患者作为研究对象。所有患者均为初治患者，且符合TNBC的诊断标准，并经有经验的病理医生复核切片免疫组化及FISH确诊；年龄35～67岁，中位年龄51岁，癌旁正常的乳腺组织作为此次分析的对照组，留取术后新鲜组织(-80℃环境存储)与石蜡包埋组织。

1.2 方法

1.2.1 miR-146a的测定方案 使用新鲜冻存标本开展miR-146a测定，测定方法是荧光PCR，首要步骤为获取相应的总RNA。使用TRIzol试剂盒提取总RNA，总RNA浓度通过测量来评估。使用NanoDrop分光光度计在260 nm和280 nm处的吸光度。将提取的总RNA按RNA反转录试剂盒(Reverse-aid-first-strang-cDNA合成试剂盒购自Synthesis Thermo Fisher Scientific 公司)说明反转录RNA为cDNA，合成的 cDNA使用TB GreenTM Primix Ex TaqTM试剂盒(Takara Bio 公司)通过 PCR 仪进行扩增检测，以U6为内参检测各组miR-146a表达。此次设计采用的miR-146a引物[6]：上游：5′-CTATCGGGAACGACCG-3′；下游：5′-ACACATTGAAGGTCCCCTT-3′；同时运用U6为内参。PCR反应设置：95℃ 5 min，对此进行1次循环的操作；95℃ 25 s ，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15 个循环；93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，35个循环。60℃的时间点获取荧光讯号，记载相应的Ct值。应用2-ΔΔCt法分析详细表达状态。ΔΔCt=[ Ct目的基因(未知)-CtGAPDH(未知)]-[Ct目的基因(校正样品)-CtGAPDH(校正样品)]。

1.2.2 免疫组化方法 使用石蜡包埋组织进行免疫组化检测。在此次方案设计中，实际运用的Ki67与VEGF试剂，都源自于北京金桥，方案中运用了二步法、DAB显色的处理方案。对Ki67的表达位置在细胞核，表达相对明显的3个高倍(400倍)位置分析具体的阳性率数据，采用Ki67阳性率为此次分析所运用的增值指数。VEGF评估方案：阳性位置位于细胞质，对此选择3个高倍(400倍)观察视角，依次开展阳性率和着色强度的计算工作。阳性率：<25%在此次分析中判定为1分，26%～50%在此次分析中判定为2分，51%～75%在此次分析中判定为3分，>75%在此次分析中判定为4分。着色强度：没有色彩归入0分，淡黄归入到1分，棕黄归入到2分，棕褐则是归入到3分。两个数据进行乘法计算，为此次分析的最后评分，实际区间是0～12分。安排有丰富经验的医师，运用盲法的方式进行诊断。

2 结果

2.1 TNBC癌组织及癌旁组织中miR-146a的表达 两组组织的miR-146a表达量区别显著，存在统计学价值(P<0.001)，观察组内miR-146a的具体表达数据显著小于对照组(见表1、图1 ) 。

图1 两组中miR-146a 表达的柱状图

表1 TNBC癌组织及癌旁组织中miR-146a的表达

2.2 观察组不同临床病理特征中miR-146a的表达 观察组中miR-146a的表达指标分析，可发现是否存在淋巴结转移、不同TNM分期都有显著的区别，该区别存在统计学意义(P<0.001)。在年龄、肿瘤大小与分化不同方面并不存在统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征中 miR-146a表达比较

2.3 观察组中miR-146a与增殖指数的关系 使用Pearson相关分析，发现观察组中miR-146a的指标和增殖指数之间表现为负相关的关系 (r=-0.909 ，P<0.05)。见图2。

图2 miR-146a与增值指数的关系散点图

2.4 观察组中 miR-146a与 VEGF的关系 使用Pearson相关分析，发现观察组中miR-146a的指标和VEGF之间表现为负相关的联系(r=-0.960 ，P<0.05)。见图3。

图3 miR-146a与VEGF的关系散点图

3 讨论

TNBC是一类具有高度异质性的恶性肿瘤，严重危害了女性健康。大约15%～20%的乳腺癌患者为TNBC[7]。在过去的几十年中，随着治疗手段的增加和治疗水平的提高，乳腺癌的治疗效果得到了显著提升，5年生存率明显提高，总体死亡率明显下降。然而，由于TNBC肿瘤侵袭性强，更容易发生内脏转移。且治疗手段单一，目前TNBC的治疗仍以化疗为主，缺乏内分泌治疗及抗HER-2治疗靶点。3年的治疗复发率高达40%～50%[8]，预后仍然很差。TNBC目前在治疗方面迫切需要寻找新的治疗靶点，以提高治疗效果，改善患者的生存率。近年来微小RNA成为恶性肿瘤的研究热点，其主要功能是在转录过程中发挥重要作用。miRNA作为非编码单链小分子RNA，在各类细胞中都有较多的存在。miRNA为转录后重要的调控因子，对此可依靠目标RNA的分解，进一步产生的控制表达的效果，也可对miRNA翻译进行控制，有效调控转录后的表达信息，其在实际的生长和发育等程序中，都发挥着非常重要的调节作用[9]。miR-146a位于5号染色体的LOC285628，成熟序列位置是第2外显子。miR-146a水平在胃癌、膀胱癌等多种癌症组织中存在异常表达[10-12]，但目前在TNBC的表达还未见报道。为寻找新的治疗靶点，提高治疗效果，本研究探讨miR-146a 在TNBC中的表达及其临床意义，结果显示TNBC中miR-146a的表达明显低于对照组，提示miR-146a或许为TNBC肿瘤产生的关键分子因素，或许会介入肿瘤的进展，miR-146a为重要的抑癌基因，也有相对较强的调节功能，miR-146a在异常增殖的场景中会有显著影响，对调控失控性增殖也有显著的促进效果。当前，部分和临床特征、预后存在密切联系的标志物，都获得了业界的普遍关注。miR-146a为抑制基因的重要指标，在多个肿瘤表达中都有所下调[13-15]。miR-146a是miRNA家族的重要成员，在多个实体肿瘤的表达都出现了下调，认定其或许和肿瘤的出现与进展存在密切联系。Shomali N等[16]分析得出，胃癌肿瘤的miR-146a表现为低表达的状态，该指标可能会影响癌症迁移与侵袭，发现miR-146a可作为治疗的抑制物，运用到相关诊疗活动中。但是当前对TNBC组织的miR-146a表达和病理特征的联系少有研究。本文的结果显示观察组不同临床病理特征中miR-146a的表达在有无淋巴结转移与TNM多个分期的不同情况中，其表达都有显著的区别，该区别存在统计学意义。在年龄、肿瘤大小与分化不同的表达区别较小，并不存在统计学意义。TNBC中miR -146a的表达与淋巴结转移存在联系，代表miR-146a低表达或许和实际产生的侵袭、生长以及转移等密切相关，miR-146a低表达可使TNBC的肿瘤组织进入到生长状态。此外，miR-146a表达也和TNBC不同TNM分期存在联系，因为TNM分期可以判断预后与生物学变化，所以miR-146a低表达或许也和TNBC肿瘤预后等变化存在联系，即TNBC中miR-146a低表达或许代表预后也不理想。低表达miR-146a也代表实际疾病分期相对较高。此次分析还可发现，TNBC肿瘤内miR-146a的表达指标，和增殖指数间表现为显著的负相关关系，代表miR-146a维持低表达的状况，或许会造成肿瘤出现异常增殖，进一步促使肿瘤的发生与进展。miR-146a异常表达或许介入TNBC肿瘤的失控增殖，促进了恶性肿瘤细胞的快速生长，从而造成肿瘤体积的快速增大，使肿瘤的侵袭性变得增强。本组研究结果还显示了TNBC肿瘤组织中miR-146a的表达与VEGF的表达表现为负相关联系，miR-146a低表达可能加快VEGF的高表达，帮助肿瘤间质的血管发育，提高肿瘤组织的营养供给，进一步加快肿瘤的生长。

整体而言，miR-146a低表达或许为肿瘤发生发展的关键标志，会影响肿瘤的进展与恶化，miR-146a低表达和细胞增殖与VEGF调控存在关系。目前由于TNBC在治疗方面手段单一，迫切需要寻找新的治疗靶点，肿瘤进展可能与肿瘤新生血管、信号通路等因素有关。另外，细胞周期和免疫缺陷可能也是影响乳腺癌发生发展的重要因素[17]。