HMGB1对LPS诱导A549细胞自噬表达的调控作用

农进，梁琼，廖林，李军，韦凌云，陆江玉，陈红，廖品琥

(1. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2. 广西大学医学院，广西 南宁 530004；3. 右江民族医学院重症医学教研室，广西 百色 533000)

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorty distress syndrome，ARDS)是ICU病房中常见的一种严重综合征，随着俯卧位通气、体外膜肺氧合(ECMO)等高精技术的临床使用，其死亡率有所降低，但仍高达40%左右[1]。有研究显示过度的炎症反应失控是ARDS肺损伤的主要原因，然而使用炎症因子拮抗剂并不能有效降低病死率[2]。自噬性细胞死亡(autopohagic cell death，ACD)是近年来新发现的细胞死亡形式，有望成为ARDS新的治疗靶点。

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一种重要的细胞外晚期炎症介质，在细菌感染、败血症及其它刺激诱导的ARDS体内外模型中，HMGB1可在细胞内、核内或细胞外水平调节自噬。HMGB1与自噬相互作用在不同细胞类型中有着不一样的机制，且依赖触发损伤的性质[3]。内毒素是感染的重要原因之一，其主要成分为脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，本实验使用LPS刺激A549细胞，探讨HMGB1对肺泡上皮细胞的自噬是否具有调控作用，为制定新的治疗策略打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 A549 细胞购于中国科学院干细胞库；LC3a/b、HMGB1、β-actin购于Affinity；CCK-8试剂购于Fluorescence；转染试剂LP-2000购于invitrogen公司；凋亡检测试剂盒购于Solarbio；电镜固定液：索莱宝；无水乙醇、丙酮购于国药集团化学试剂有限公司；812包埋剂购于SPI；凋亡检测试剂盒购于Solarbio公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的复苏、传代 从-80℃冰箱中快速取出细胞冻存管，立即放入37℃温水中融解；A549细胞复苏后常规培养、换液，当细胞生长至覆盖培养瓶约80%面积时，对细胞消化、传代后用于后续培养。

1.2.2 CCK-8 检测LPS对A549细胞存活率的影响 取对数生长期的细胞接种于96孔板中。浓度为1×104个/毫升，加入不同浓度药物，同时设置空白组、正常对照组，每组设3个复孔，37℃，5%CO2培养箱中培养24 h；加入CCK-8溶液后，37℃，5% CO2培养箱中孵育2 h；测450 nm处的吸光度。

1.2.3 药物处理分组 (1)A549细胞融合度达80%时，分别用不同浓度的LPS作用于A549细胞24 h，100 μg/ml处理不同时间；(2)随机将细胞分为：①空白组；②LPS组；③Si-HMGB1组；④Si-HMGB1+LPS组。Si-HMGB1处理组中先siRNA转染A549细胞后，加入100 μg/ml LPS 24 h。

1.2.4 细胞凋亡的检测 A549细胞培养、消化后，分为空白组和LPS组。严格按照流式细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。

1.2.5 透射电镜法检测自噬超微结构 取对数生长期的A549细胞，加入100 μg/ml的 LPS，培养24 h后，随后取材、固定、脱水、渗透、包埋、切片、染色等步骤处理后透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.2.6 Western blot检测相关蛋白表达 提取细胞的总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。每组取等量蛋白行10%SDS-PAGE 凝胶电泳，转移凝胶至PVDF膜，室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育90 min，洗膜，ECL发光显影。通过Image J软件对蛋白印迹条带灰度值进行半定量分析，采用目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值来获得目标蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 LPS对A549细胞存活率的影响 使用不同浓度的LPS作用于A549细胞24 h后，CCK-8 法检测结果见图1显示，剂量<100 μg/ml的LPS处理后，细胞活性无明显改变，与正常对照组(0 μg/ml)相比，差异无统计学意义(P>0.05)，剂量达到100 μg/ml之后细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，取此剂量用于后续ARDS肺泡上皮细胞损伤的细胞造模剂量。

注：与空白对照组(0 μg/ml)相比，*P<0.01。图1 CCK8检测不同剂量的LPS对A549细胞活力的影响

2.2 最低细胞毒剂量的LPS对A549细胞损伤不依赖凋亡和坏死 为了进一步验证细胞存活率的下降是否依赖于凋亡和坏死，采用Annexin V-FITC 和PI双染法，检测100 μg/ml的LPS作用于A549细胞24 h的细胞凋亡和坏死情况。由图2散点图可见，LPS 处理组的B1、B2、B4与对照组比较，细胞数无明显增加，细胞凋亡率、坏死与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。可见，浓度为100 μg/ml的LPS作用A549细胞之后，细胞存活率下降不依赖于凋亡和坏死。

注：上图为空白组和LPS组的散点图，下图为两组细胞凋亡率统计分析结果。图2 流式细胞技术检测LPS对A549细胞凋亡影响

2.3 LPS诱导后A549细胞透射电镜观察细胞超微结构 透射电镜观察如图3所见：正常对照组中：未见典型结构自噬小体，自噬溶酶体(ASS)少量存在。LPS组中：线粒体数量较少，胞质中大量的自噬小体(AP)和自噬溶酶体，未见调亡小体形成，核膜完整。结果提示LPS 能引起 A549细胞自噬，结合上述流式细胞检测结果及自噬性细胞死亡的特征，LPS引起的细胞存活率下降为自噬性细胞死亡。

图3 LPS诱导后 A549细胞的透射电镜细胞超微结构

2.4 RNA干扰A549细胞HMGB1后各组蛋白表达比较 为了验证HMGB1是否可以介导LPS诱导的A549细胞自噬及自噬性细胞死亡，我们使用最低毒性剂量的LPS(100 μg/ml)刺激A549细胞24 h，联合使用siRNA 干扰HMGB1 的表达干预A549细胞，Western blot实验检测自噬相关蛋白。结果如图4所见：正常组的A549细胞仅有微量的HMGB1和自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达，LPS诱导后明显增加A549细胞HMGB1和LC3B-Ⅱ的蛋白表达量。Si-HMGB1干预后，LC3B-Ⅱ/LCB3-1和HMGB1的蛋白表达量介于LPS组和空白组，与LPS组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Si-HMGB1能抑制LPS 诱导A549细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达。

注：与空白组比，#P<0.01；与LPS组相比，★P<0.01；与LPS组相比，*P<0.05。图4 Si-HMGB1对A549细胞HMGB1和自噬蛋白表达的影响

3 讨论

ARDS 的病因复杂，有肺内因素的直接作用和肺外因素间接作用，其中脓毒症或脓毒性休克是 ARDS 发病的主要原因，也是急危重症病房死亡率很高的综合征。正常情况下，自噬能维护细胞稳态，有利于细胞的存活，起到清除细胞内垃圾的作用[4]。然而当刺激因素到达一定时间，刺激强度超过一定范围时，会出现不利于细胞存活的作用，正确认识细胞自噬的双重作用及其具体的分子机制有利于ARDS的防治[5-6]。

HMGB1广泛分布于肺、脑、肝、心、肾等各器官。在细胞核内，HMGB1可与DNA非特异性结合，参与复制、重组、转录和DNA修复等过程，参与多种生命活动，病理情况下，胞内HMGB1可通过主动分泌与被动释放进入胞外，进而参与炎性反应，HMGB1在炎症过程中起重要作用[7]。细胞外的HMGBl通过促进核因子(NF)-kB的核易位而导致炎症细胞因子的释放，从而诱导ARDS，参与细胞凋亡和自噬[8-9]。HMGB1作为脓毒症的晚期炎症因子，据报道，内毒素诱导动物模型中，HMGB1在诱导后8 h时表达明显增高，至32 h仍然维持较高水平[10]。有关HMGB1和自噬在ARDS肺上皮细胞损伤的研究表明，自噬激活剂可抑制LPS诱导的A549细胞的凋亡，并改善小鼠ARDS的肺损伤[11]。研究还发现LPS刺激A549 细胞产生自噬和ACD，自噬表达量依赖于LPS的作用的时间和浓度，自噬激活剂可加重细胞损伤[12]。可见，自噬对细胞具有双重作用。研究也发现，在氧化应激过程中，HMGB1能促进自噬，抑制HMGB1出核可以降低ARDS的自噬和减少细胞死亡[13]。HMGB1和自噬与ARDS的肺损伤发病机制关系密切。

本研究结果显示，正常组A549细胞自噬水平表达很低，使用最低剂量的细胞毒性的LPS作用于A549细胞24 h后HMGB1和自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达量增加，并出现不依赖于凋亡、坏死的细胞存活率下降。研究认为ACD的特征为：胞质中大量的自噬小体，无调亡小体形成和细胞核无变化，不依赖于caspase[14-15]。我们采用透射电镜观察到LPS可引起A549细胞自噬，且胞质中出现了大量的自噬小体和自噬溶酶体，未见调亡小体形成，核膜完整等ACD的特征。可见，100 μg/ml的LPS作用于A549细胞24 h后可出现ACD。为了进一步验证HMGB1与A549细胞自噬和自噬性细胞死亡关系，实验采用RNA干扰技术沉默HMGB1，结果通过干预后LPS诱导的A549细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达明显下降，提示HMGB1可介导LPS诱导A549细胞自噬与ACD。既往研究发现，当高水平的自噬持续刺激，超出阈值时，对细胞是不利的，参与疾病的发生发展[16]，我们的研究与该研究相符。

综上所述，本研究发现LPS诱导A549细胞产生自噬及自噬相关的细胞死亡，可能参与肺泡上皮细胞损伤过程，抑制HMGB1可降低LPS诱导的A549细胞的自噬。由此推测，当脓毒症的病情发生发展到一定阶段，可引起肺泡上皮细胞ACD从而导致了ARDS的发生，由此可对ARDS患者进行自噬表达的检测，根据自噬表达量，通过干预HMGB1来调节自噬有望成为ARDS治疗的靶点。