骨桥蛋白与生殖系统疾病的相关性研究进展

韦玉霞，廖碧云，陆玉兰，胡林林，张婷，莫海艺，陈兴鸿，杨凤莲

(右江民族医学院附属医院生殖医学中心，广西 百色 533000)

骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种普遍存在于哺乳动物的多功能糖基化酸性蛋白，在1979年首次被发现，富含天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸，因其介导骨组织细胞与骨基质的连接，故被称为骨桥蛋白[1]，也被称为早期T淋巴细胞活化1和骨涎蛋白1[2]，是一种分泌磷蛋白，属于小整合素结合配体连接蛋白(SIBLING)家族的一部分。OPN最初被认为是一种骨基质蛋白质，随后被发现它还是一种细胞因子，参与了致癌、组织形成和免疫反应。OPN由破骨细胞、内皮细胞、活化的巨噬细胞及活化的T细胞等分泌，广泛分布于体内各种组织和细胞中，也存在于血液、母乳等各种体液中[3]。OPN具有多种生物学功能，研究发现其参与骨基质的矿化和吸收、组织创伤修复、细胞黏附与趋化等许多生理过程，在泌尿、心血管、免疫、消化等多个系统中发挥着重要的作用[4-5]。近年OPN在肿瘤方面的研究得到国内外学者的高度关注，已有证据证明其参与肿瘤细胞的发生、浸润和转移过程[6-7]。 有研究发现其在哺乳动物生殖系统中广泛存在并在生殖过程发挥重要的作用[8]。随着生物信息学及基因测序技术的发展，使人们从基因水平找出疾病发生的易感基因成为可能。为此，本文对OPN及其基因在生殖过程的作用进行综述。

1 OPN的结构、生物学功能与分布

OPN在哺乳动物中普遍存在，经过翻译修饰后的OPN蛋白，在不同的哺乳动物细胞中合成的分子大小也有不同，分子量为44～75 kd，呈中度同源。从NCBI和UniProt数据库(https://www.ncbi.nlm. nih.go-v/gene/6696和http://www.uniprot.org/uniprot/P10451)查询得知，OPN具有5种不同的转录变体，它们编码了OPN基因的5种亚型，分别是OPN-a、OPN-b、OPN-c、OPN-d、OPN-e，以前3种较多见。在生成稳定的OPN蛋白前，编码OPN的基因在蛋白质的加工修饰阶段如转录、翻译等均经历了很大的变化，尤其是丝氨酸和苏氨酸残基都进行了糖基化和磷基化，这在介导骨组织细胞与骨基质的连接过程中发挥重要作用。OPN由多个高度保守的结构域组成，包括N端的谷氨酰胺转移酶结合残基(OPN-OPN间接交联聚合物)、丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化位点、凝血酶裂解位点(RSK)、金属蛋白酶切割位点、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构域(GRDGD)、钙结合结构域、七肽序列(SVVYGLR )结构域和C端的肝素结合结构域[9-10]。其中，钙结合区域在钙离子介导或参与的反应过程中起重要作用，使得RGD序列与整合蛋白结合，促进细胞间的黏附，细胞迁移和细胞外基质相互作用，此外，OPN可通过RGD位点作为配体结构结合几种不同的整合素，包括 αVβ1、αVβ3、αVβ5、α4β1、α9β1，其中αVβ3 是其主要受体。OPN的细胞信号传导通路是通过其与αVβ3-整合素或CD44结合后相互作用而实现。当OPN被凝血酶片段切割时，暴露了隐藏在OPN分子内部的整合素连接位点162SLAYGLR168，整合素α4β1和α9β1便与后者结合，结合后所形成的结构在细胞黏附中起着重要作用[11]。有研究指出， OPN分子的氨基端区域与外分泌有关，N-末端富含天冬氨酸序列、钙结合位点，N端的功能区还与肿瘤播散有关；羧基端结合肝素结构域，C-末端参与黏附功能的调节，还与免疫逃逸有关[12]。

OPN主要由成骨细胞、破骨细胞、血管与骨骼肌细胞等合成，也可由中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞合成和分泌，其广泛分布于机体各种组织和细胞中。OPN的分子结构决定了其具有多种生物学功能，与不同的受体结合便产生不同的生物学效应。它是骨重塑的一个重要因素，将破骨细胞锚定在骨的矿物基质，在生物矿化中发挥重要的作用；促进细胞介导的免疫应答[13]；RGD序列与整合素或CD44v 6/7结合形成表面糖蛋白参与细胞间相互作用；OPN还可以激活细胞内通路，调节免疫系统内的基因表达[14]。总之，OPN参与体内平衡和病理过程，包括慢性炎症和肿瘤的发生发展过程。

2 OPN基因及其表达

3 OPN与生殖

在生殖系统中，OPN在输卵管、子宫、胎盘、睾丸、附睾、精子和附属性腺液等生殖系统均有表达，其生物学功能涉及妊娠识别、胚胎植入、滋养细胞入侵和胚胎发育等。因此，研究 OPN 蛋白表达水平及其基因在生殖领域的关系，可以帮助我们更深层地了解受精过程，找出关键基因成为治疗生殖疾病的新靶点，或应用于辅助生殖技术(ART)，以提高妊娠成功率或受精率。

3.1 OPN及其SNP与男性生殖 OPN表达水平及其基因在输精管道(附睾、输精管、射精管、尿道)、睾丸和附属腺体(精囊腺、前列腺、尿道球腺)中的研究已成为雄性哺乳动物生殖领域研究的热点。早在1992年，Brown LF等[22]发现了OPN表达于男性前列腺及睾丸纵隔的上皮细胞中。随后，国内外学者先后对雄性牛、羊、狗、猪、鼠等进行了研究，Erikson DW等[23]发现OPN在荷斯坦牛精子、附睾液和睾丸匀浆中均有表达，我国学者刘倩等[24]进一步证实OPN在小鼠睾丸、附睾组织和精子中呈现特征性表达，用免疫组化方法发现精原细胞、精子细胞中OPN表达浓度高于支持细胞(Sertoli细胞)、Leydig细胞以及各级生精细胞，因而推断出OPN可能参与精子的发生及成熟过程，进一步提出OPN可能与精子的活力和受精能力密切相关。

Moura A等[25]的研究显示，OPN在雄性哺乳动物生殖系统中表达浓度的高低跟其生育能力存在一定的相关性，他们发现高生育率的荷斯坦公牛在其附属性腺体液中OPN的浓度水平高于低生育公牛，从而认为OPN是与生育有关的精浆蛋白之一。在体外试验中加入一定浓度的OPN蛋白液可以使精子在获能、精卵结合以及受精卵的早期卵裂具有促进作用。如Boccia L等[26]通过体外试验，发现在水牛精子与卵母细胞结合的培养基中加入适量浓度的OPN液，孵育4 h后观察发现精子发生顶体反应的百分率较没有OPN液的对照组增加，该试验证明OPN具有诱导精子获能的能力，特别是有肝素同时存在的情况下，显示出明显的协同作用，进一步推断了OPN在肝素诱导精子获能进程中起着介导作用。此外，还有研究指出，OPN介导的精子获能以及顶体反应与细胞内钙代谢水平有关[27]，可能是射精时精子膜上的OPN通过肝素结合域结合肝素，这种OPN-肝素复合物能引起细胞内钙含量的升高，进而使精子获能。

Rodríguez CM等[28]利用Northern blot技术和原位杂交技术从基因水平证实了OPN在单倍体男性配子中的存在。OPN 基因内的SNP有的会对精浆中OPN蛋白的表达产生积极或消极的影响，从而影响繁殖能力。Rorie RW等[21]研究OPN基因启动子SNP与牛精液质量的关系，发现在牛OPN基因启动子区有7个SNPS能影响精子质量，特别与精子运动质量有关，其中在bp3379位点上的SNP，是由鸟嘌呤代替胸腺嘧啶，这一突变能改善精子运动促进精子快速游动。

在关于男性精子单核苷酸多态性的研究中，Markandona O等[29]认为MLH3基因的SNP rs175080位点与白种人少精子症有关。Anifandis G等[30]选择男性携带MLH3基因单核苷酸多态性(SNP) rs175080并接受胞浆内精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)治疗的夫妇从胚胎学角度进行研究，首次提出该基因SNP位点 rs175080的突变因精子性状的改变对体外受精及胚胎发育没有影响。当然，上述论断还需开展更多的研究去印证，但这些研究策略为我们研究OPN基因单核苷酸多态性是否在生殖领域产生影响提供新的研究思路。

3.2 OPN及其基因在子宫及输卵管中的表达 除了OPN在雄性哺乳动物生殖系统中的表达研究之外，OPN在雌性哺乳动物生殖系统中也有特征性表达。von Wolff M等[31]通过免疫组化法研究发现，在女性子宫内膜的周期性变化中，OPN mRNA在子宫内膜分泌期中的表达量明显高于增生期，且分泌中期和晚期OPN含量比分泌早期和增生期高约5～10倍，进一步研究发现OPN mRNA仅在内膜上皮细胞表达，而基质细胞未见有表达。von Wolff M等[31]和Tulac S等[32]分别应用原位杂交法和酶联免疫法对子宫内膜中的OPN表达水平进行研究，其研究结果与上述结果相似。以上研究表明，OPN高表达于子宫内膜上皮细胞分泌期的中、晚期。

除了在子宫内膜的表达，OPN还在输卵管液中也被发现。Gabler C等[33]在牛输卵管液中发现三种OPN分子亚型，分别是OPN-a、OPN-b和OPN-c，其中OPN-a亚型在整个周期各期间输卵管液中表达量最多。还有研究人员通过RT-PCR和免疫组织化学法从小鼠输卵管液中检测OPN mRNA和蛋白的表达，发现OPN mRNA表达水平的高低规律性与小鼠排卵周期呈现同步规律性，即排卵期OPN mRNA浓度达到最高值，黄体期OPN mRNA浓度迅速减少，这种现象与雌激素水平的变化一致，推测输卵管中OPN mRNA的表达可能受雌激素的调控[34]。王佳佳等[35]研究结果也与上述结论一致，提出OPN蛋白表达受到雌激素的调控，而且两者呈正相关。雌激素能够调控OPN表达水平，其作用机制可能是通过雌激素PI3K/Akt磷酸化信号通路的调节，激活雌激素PI3K/Akt磷酸化信号转导通路后使低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α)升高，OPN是HIF-1α在PI3K/Akt信号通路的下游靶基因，受HIF-1α调控。因此，OPN的异常表达也会影响卵巢卵泡细胞对雌激素的分泌。

3.3 OPN在生殖过程中对胚胎形成的作用 妊娠过程大致可以分为受精卵受精、胚胎着床、胎盘形成与胚胎发育这几个阶段，它是一个十分复杂的过程。在妊娠与非妊娠的子宫内膜上皮细胞中，OPN的表达亦有区别。冉静等[36]用小鼠研究发现，在孕期小鼠子宫内，其内膜上皮细胞的OPN mRNA表达具有较强的时段性，小鼠妊娠第4.5天OPN mRNA表达水平最高，其次是第3.5天和第5.5天表达稍弱，第6.5天表达最弱但仍高于非妊娠小鼠，提示OPN参与妊娠与胚胎着床过程。

OPN在胚胎着床中还发挥着另一个重要的作用，就是对子宫内膜容受性建立过程中的重要参与。Carson DD等[37]通过基因水平研究，发现在胚胎植入子宫过程当中，当受精卵和子宫内膜发生相互作用时OPN mRNA在其中发挥黏附和介导作用，促进胚胎着床。进一步研究发现，内膜容受性的标志性蛋白整合素αVβ3能够特异地表达于胚胎着床期的内膜种植窗，而整合素αVβ3又是OPN蛋白的重要受体，其机制是OPN通过特征性RGD序列识别整合素αVβ3受体并与之结合，两者在胚胎和子宫内膜之间起着介导和黏附作用。因整合素αVβ3正是OPN 蛋白的受体之一，提示OPN也参与子宫内膜容受性的建立。胚胎植入过程和滋养细胞的侵袭被认为是影响妊娠成功的主要因素。滋养细胞黏附于子宫内膜后增殖分化为几种类型的滋养细胞，包括绒毛滋养细胞(VTs)和外渗滋养细胞(EVTs)。有研究[38]表明，OPN参与了妊娠期滋养细胞的增殖和侵袭，OPN在绒毛状滋养细胞外壁滋养细胞中有较强的表达，滋养细胞可侵入母体子宫内膜和子宫螺旋动脉，促进胎盘的形成和组织的重塑。OPN还与胚胎滋养层浸润的深度有关，表明OPN在胚胎着床过程中伴随着胎盘的形成也起着作用。OPN在胚胎植入过程中能够限制胎盘滋养细胞的过度侵蚀、下调母体抗胎儿的免疫应答，这有利于胚胎的成长。可以看出，OPN是影响子宫胚胎微环境的重要部分，它参与胎盘的形成并促进胚胎发育和成熟。

陈善萍等[39]分析OPN基因单核苷酸多态性位点rs4754的各等位基因和基因型在广西壮族人群中的分布频率，以及对比其在不同种族中的分布差异，研究结果显示，骨桥蛋白基因SNP位点rs4754等位基因和基因型在广西壮族人群中的分布频率与其他地区人群相比存在差异。韦贵将等[40]认为骨桥蛋白基因rs11728697位点的基因型和等位基因频率与欧洲人群、日本人群和非洲人群存在差异。上述研究提示不同种族间OPN相关疾病临床表现及发病率的差异可能是该基因单核苷酸多态性的差异导致，但OPN基因单核苷酸多态性在生殖领域的研究未见有报道。

4 小结与展望

综合上述研究，OPN不管是在男性生殖还是女性生殖系统表达调控及其胚胎形成和妊娠的发生和发展中都扮演着重要的角色。在男性精子运动或精卵结合过程中精子的获能、胚胎的发生及其定位于子宫着床、子宫-胚胎微环境的改变、胎盘的形成等过程均发挥举足轻重的作用。关于OPN在男性和女性生殖系统中的作用及其在生殖领域中的研究已经比较成熟，但其研究更多地体现于蛋白层面，而生殖系统OPN基因单核苷酸多态性的表观遗传学研究仍是较为少见。另一方面，OPN参与的雌激素合成过程，还涉及其它生殖相关基因的表达和PI3K/Akt通路的调节等；从纵向方面看，OPN基因可以联合其它更多的生殖相关基因研究，基因-基因和基因-环境的交互作用在生殖领域的作用还有待投入研究，但还相对表浅，多基因联合不同通路在生殖相关疾病发生发展中的机制仍需更多的实验和数据进一步丰富。