次氯酸荧光探针的研究进展*

陈嘉丽，谌文强，盛家荣

(南宁师范大学 化学与材料学院,广西 南宁 530001)

活性氧(ROS)是具有化学活性的含氧分子，包括过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HClO)、超氧化物自由基阴离子(O2·-)和羟基自由基(·OH)。活性氧会引起氧化应激，这些应激涉及多种生理和病理过程，造成癌症和神经退行性疾病[1]的发生。此外，环境中的一些活性氧(ROS)还是威胁人类健康的污染物。由于这些影响，需要一种灵敏的方法去研究它们的生物学作用及其在环境样品中的浓度。荧光探针通过把生物系统中的化学信号以光的信号转换，从而对生物系统进行稳态检测。近几年来，荧光探针法因其独特优势发展迅速，将荧光探针法作为检测生物体内活性氧稳态的方法已成为国内外学者进行科学研究的重要手段。

1 次氯酸概述

氯酸(HClO)是最重要的活性氧(ROS)之一，其可用作家庭漂白剂以及游泳池和饮用水的消毒剂，在人们的日常生活中广为使用。在髓过氧化酶催化下，HClO可由由线粒体中的H2O2和氯离子反应生成。HClO的pKa(酸度系数)为7.46，在生理条件下(pH=7.4)，HClO处于平衡状态，其可破坏侵入性细菌和病原体，是免疫防御系统的一部分，在各种生理过程和病理过程中起着至关重要的作用。HClO可以与生物体中的各种生物分子发生反应，如DNA，RNA，脂肪酸，胆固醇和众多蛋白质[2]。虽然HClO对保护我们生命的健康有积极意义，但当生物体内HClO含量及分布异常，会导致氧化还原稳态失衡，导致氧化应激的产生[3]，可能引起一系列疾病的发生，如肺损伤[4]，肾脏疾病[5]和神经退行性病变等[6]。

2 荧光探针概述

在复杂的生物体内，各种活性物质(活性硫、活性氧和活性氮等)对其系统运转发挥着重要作用。在机体正常运转的情况下，活性物质的浓度水平可维持在一个平衡的状态。当活性物质在体内的含量出现异常，则会对生物体的系统运转产生不良影响，进一步导致一系列疾病的产生[7, 8]。

荧光探针法可将化学信号转化为光信号，从而达到对生物系统进行检测的目的。近几年来，荧光探针法发展迅速，在生物学及临床医学上的应用也日趋成熟，也因此成为科研工作者用于检测生物体内活性物质的重要手段[9-12]。目前，可用于检测生物体内活性物质的方法主要有以下几种：质谱法[13-15]、高效液相色谱法等[17]。相对于荧光探针法，这些检测手段显示出较多的不足，如检测过程繁琐，选择性差等。而荧光探针法在面对复杂样品时，依然可以显示出空间分辨率高、检测限低、选择性和生物相容性好的优点。荧光探针法因其独特优势已在生物医学和临床诊断中得到了大量的应用，近年来，利用荧光探针法来检测生物体内活性物质也成了科研工作者聚焦的方向。

2.1 荧光探针的识别机理

荧光探针通过利用主体与客体间特定的相互作用而引起系统荧光性质的变化，一般来说，荧光探针的识别机理主要有：光诱导电子转移(photoinduced electron transfer，PET)，分子内电荷转移(internal charge transfer，ICT)，荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)等。

2.1.1 光诱导电子转移(PET)

基于PET的荧光探针一般由识别基团(电子供体)和荧光团组成，二者通过连接臂连接。PET型探针在与待测分析物反应前，其荧光团和识别基团之间会发生光诱导电子转移效应，探针分子荧光淬灭。加入分析物反应后，PET效应受到抑制，荧光恢复，因此光诱导电子效应常用于设计“off-on”型荧光探针。

2019年，华东理科大学王成云课题组报道了一种基于PET的荧光探针(NY-Lyso)[18](如图1所示)，该探针由溶酶体靶向基团吗啉基和亚硫酸氢盐的特异性结合位点这两个功能部件组成。该探针设计了两个响应位点，分别通过PET和ICT控制萘酰亚胺荧光团的荧光。在亚硫酸氢盐存在下，半花菁苷的共轭结构被破坏，通过抑制ICT过程使荧光强度的部分增强。当将SO2探针复合物暴露在酸性环境中，溶酶体靶向基团和吗啉基团将被质子化，PET过程也被阻断，荧光增强。

图1 基于PET机理的荧光探针

2.1.2 分子内电荷转移(internal charge transfer，ICT)

基于分子内电荷转移机理(ICT)是设计比率型荧光探针的惯用机理，其分子内存在着“推-拉”电子效应。基于ICT机理的典型荧光探针分子通常为D-π-A结构，D为富含电子的推电子基团，A为具有吸电子能力的拉电子基团，如烷氧基(-OR)和氨基(-NH2)等。二者可作为识别基团或者其中一部分，通过π键连接，得到D-π-A结构，分子内电子供给能力不一的基团的存在即可形成电子推拉效应。

2019年，韩国亚洲大学的Hwan Myung King和英国巴斯大学的Tony D. James, Simon E. Lewis报道了一种新的生物成像荧光团azulene，其与硼酸酯受体基序相连后，可成为一种用于活性氧检测的荧光探针[18](如图2所示)。由于探针中硼酸酯的吸电子效应，探针分子内电荷转移(ICT)效应减弱，探针分子几乎没有荧光，当ROS/RNS存在的情况下，硼酸酯基团的碳-硼键发生氧化形成碳-氧键，增强了分子内的ICT效应，荧光增强。

图2 基于ICT机理的荧光探针

2.1.3荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)

基于FRET设计的荧光探针分子一般由两个荧光团组成，分别充当能量供体和能量给体的角色。荧光共振能量转移指供体荧光团能量向受体荧光团转移的过程，当二者受到外界光源激发时，以非辐射跃迁的方式实现能量的转移。

2019年，Brady课题组发展了第一代基于活性配体的荧光共振能量转移(FRET)铜探针-FCP-1，用于检测活细胞中不稳定的铜(I)池[20](如图3所示)。利用三(2-吡啶基)甲基胺桥(TPA)配体和Cu(I)的裂解反应，设计开发了FCP-1探针。FCP-1通过TPA将荧光素(FRET donor)和罗丹明(FRET accepter)染料连接起来，TPA是能够特异性结合Cu(I)的活性分子。当没有Cu(I)和探针结合时，这个分子会发生很高的FRET和罗丹明主导的荧光发射；当Cu(I)和这个探针结合，在有氧条件下会发生依赖于Cu(I)的氧化裂解反应，使得荧光素从探针上分离出来，FRET变低，产生荧光素主导的荧光发射。

图3 基于FRET机理的荧光探针

2.2 次氯酸荧光探针的研究进展

近年来，荧光探针以其灵敏度高、生物相容性好、操作简单等优点，在体内外实时检测次氯酸方面得到了广泛的应用。到目前为止，已有许多荧光探针被设计用于次氯酸识别检测，它们具有单光子/双光子、开/关比不同的激发和发射模式。与单光子荧光探针相比，双光子荧光探针具有穿透组织深、光损伤小、背景干扰小等优点。此外，比率型荧光探针有两个相关的发射信号，可避免仪器和环境因素造成的检测误差，从而表现出更好的灵敏度。此外，大斯托克斯位移是荧光探针的理想特性，它可以大大降低自吸收，避免入射光的干扰。这些性质使得这种探针更适合于次氯酸的定量检测。

2017年，魏辉课题组设计合成了一种新型的硼酸酯荧光探针R1用于选择性检测HClO[21]如图4所示)。不同于大多数的氧化氢(H2O2)荧光探针，该工作利用探针与HClO发生的先氧化、后氯化反应使得探针的荧光发生红移，实现了对HClO的特异性检测。而H2O2只能与探针发生氧化反应消除硼酸酯基团，并不能使探针荧光发生明显变化，其它的ROS均不能与探针作用。此外，探针对于HClO的检测具有很高的灵敏度，检测下限达到6.4 nm。除了具有很好的选择性和灵敏度，该探针还具有很好的光稳定性。另外，探针与HClO反应速度很快，只需2分钟左右即可完全反应，避免了硼酸酯探针与H2O2反应速度较慢的问题。

图4 探针R1对HClO的识别检测示意图

2018年，Wu课题组报道了一例新型荧光探针TQC-HClO[21](如图5所示)，用于成像活细胞中HClO氧化和Cys/Hcy还原的过程。具有环-硫代缩醛基的7-二乙氨基香豆素(DAC-HClO)可被次氯酸氧化成3-乙酰基-7-二乙氨基香豆素(DAC)(图1.5a)。2020年，针对该研究，Song课题组作者认为DAC-HClO分子中，二乙氨基的给电子能力不够，当DAC-HClO中的环-硫代缩醛基在次氯酸作用下形成DAC中的乙酰基时，二者吸电子强度微小变化不能驱动大的分子内电荷转移效应(ICT)效应，因此不会引起较大的光谱变化。因此作者假设，显著增强香豆素染料中电子供体的给电子强度将实现大的ICT效应变化(即使电子受体的强度从环-硫代缩醛基轻微变化为乙酰基)从而产生大的光谱变化[23]。因此，作者使用更强的电子供体久洛利定(一种强的电子供体)取代化合物DAC-HClO和DAC中的二乙氨基，得到化合物JUC和JUC-HClO(图1.5a)，以增强ICT效应。作者期望在JUC和JU-HClO之间观察到良好的光谱分离。遗憾的是，JUC-HClO的ICT效应变化仍然很小，光谱重叠问题没有得到解决。作者又将强给电子体四氢喹啉基引入到香豆素中，开发出比例荧光探针TQC-HClO(图1.5b)。该比值探针具有良好的双光子特性和长波长比值发射，可用于细胞和斑马鱼体内次氯酸的成像。

图5 探针DAC-HClO、JUC-HClO、TQC-HClO对HClO的识别检测示意图

目前设计和报道了一些用于HClO荧光成像的探针，但少有可实现HClO在体内的深度成像，阻碍了与HClO相关疾病的诊断和治疗分析。2019年，Cui课题组通过以磷取代罗丹明中的桥接氧原子，开发了一种新型的近红外荧光探针PR-HClO，用于体内HClO深度成像[24](如图6所示)。罗丹明可通过分析物来调控开环过程，将其去螺环化和螺内酯结构作为一个理想分子骨架，以进行off-on式荧光生物成像。因此，硫代氨基脲部分可以锁住螺环，成为无荧光的结构，而与HClO反应后，形成噁二唑打开螺环，进而发出强荧光。此外，用磷取代桥接氧，可使吸收和荧光光谱产生明显的红移，具有罗丹明结构的优点。

图6 探针PR-HClO选择性检测HClO机理示意图

该探针最大吸收/发射波长约在710/730nm，用该探针来进行体内的次氯酸off-on式荧光成像，所获结果证实了其具有可靠的光稳定性，溶解性，快速响应(20秒)，较低的检测限(10nm)，生物相容性，荧光量子产率以及组织穿透能力。由于该探针在检测次氯酸离子时表现出来的稳定的选择性和超快的动力学，已经将其成功应用于在活的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系中对內源以及外源性次氯酸离子的荧光成像。此外，在BALB/c炎症裸鼠中对内源性次氯酸离子的三维荧光成像证实了磷原子桥接的罗丹明分子结构在对生物系统内概括性目标的深度成像具有广阔的前景。

2020年，张健博士和赵伟利教授团队构建了基于BODIPY染料的荧光探针(如图7所示)，可用于识别检测HeLa细胞和RAW 264.7细胞中外源性和内源性次氯酸的浓度波动。[25]。作者在BODIPY染料上引入N，N-二甲基硫代氨基甲酸酯作为次氯酸识别基团，设计合成新型次氯酸荧光探针DM-BDP-OCl。基于PET效应，探针DM-BDP-OCl几乎没有荧光，当用于次氯酸检测时，探针的识别基团被氧化离去，酚盐进一步发生自消除反应生成具有强烈红色荧光的化合物DM-BDP，实现对次氯酸的识别。经对探针DM-BDP-OCl系统测试研究发现，与其他ROS/RNS相比，探针DM-BDP-OCl对次氯酸具有良好的特异性和灵敏性检测能力。当探针与次氯酸反应后，荧光强度在1分钟内迅速增强112倍，经过10分钟达到相对饱和(170倍)，并且在次氯酸浓度范围为0～50μM中具有良好的线性关系，检测限为60nM。这些特性使探针DM-BDP-OCl能够快速检测HeLa细胞和RAW 264.7细胞中外源性和内源性次氯酸的浓度波动。

图7 探针DM-BDP-OCl选择性检测HClO机理示意图

3 结语

荧光探针法是检测生物体内和体外活性氧物质中的重要手段，具有响应迅速、选择性和生物相容性好、检测限低等优点，其应用已涵盖生物学领域和环境监测领域。但目前针对活性物质检测的荧光探针还存在许多不足，突出的有缺乏靶向性、精准度不够，对深层组织渗透力差等，荧光探针技术的发展还面临着巨大挑战。