当归芍药散加味方对乳腺增生大鼠Let-7a、p-ERK表达的影响

张婷婷，王 苹，张建伟

（福建中医药大学中医学院，福建 福州350122）

近年来，随着对乳腺肿瘤发病机制研究的不断深入，通过RNA干扰在乳腺肿瘤治疗中的应用有了很大的进步。研究发现，一些微小的干扰RNA对肿瘤细胞中的信号转导、细胞凋亡、分化等过程有显著的抑制作用［1］。而Let-7a就是一种微小RNA，能通过调节转录因子在RNA转录后起到调节作用，在许多肿瘤细胞的生长及分化中发挥重要作用。本文选择乳腺增生模型大鼠为研究对象，以当归芍药散加味方为治疗组，通过实时定量PCR法检测模型大鼠乳腺上皮细胞Let-7a基因的表达，以探讨当归芍药散加味方治疗乳腺增生病可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物40只SPF级SD雌性健康未孕大鼠，10周龄，体质量（193.78±5.78）g，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养于福建中医药大学动物实验中心，合格证号：2015000545959。

1.2 实验药物 当归芍药散加味方方药组成：当归15 g，芍药15 g，川芎8 g，茯苓10 g，白术15 g，泽泻10 g，浙贝母12 g，柴胡8 g，香附12 g，丹参15 g，由福建中医药大学附属第二人民医院中药房提供。常规煎煮后减压浓缩至所需浓度（含生药1 g／mL），放置于冰箱储存备用。乳消Ⅲ胶囊由福建省第二人民医院制剂科提供（院内制剂，批准文号：闽药制字Z05104028）。

1.3 实验试剂 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用药业股份有限公司）；黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份公司）；10%水合氯醛溶液、RNAiso plus［宝日医生物技术（北京）有限公司］；焦碳酸二乙脂（DEPC）水（中国索莱宝科技有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）［宝日医生物技术（北京）有限公司］；Fast SYBR Green Master Mix（2×）（美国ABI公司）。

1.4 实验仪器 生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；低速离心机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）；7500 Real time-PCR仪（美国ABI公司）。

2 实验方法

2.1 造模与分组 将40只SPF级SD雌性健康未孕大鼠，常规适应性喂养1周后随机分为空白组8只和实验组32只。实验组采用乳腺增生病动物模型经典造模法，即雌、孕激素联合序贯给药法，首先在大鼠后外肢外侧肌注苯甲酸雌二醇，剂量标准按体质量0.5 mg／（kg·d），每日1次，左右交替进行，连续肌注25 d；然后改用黄体酮继续肌肉注射，剂量标准按体质量5 mg／（kd·d），每日1次，连续5 d。空白组则用生理盐水按照0.1 mL／只肌肉注射，每日1次，连续30 d。造模结束后，将实验组随机分为模型1组、模型2组、当归芍药散加味方组、乳消Ⅲ胶囊组，每组各8只。随后即刻处死模型1组，先用肉眼观察乳腺组织的外表形态，然后用游标卡尺检测第二对乳房乳头的高度、直径，接着将第2对乳房完好剥离，用10%福尔马林液固定，待实验结束后做病理观察、RT-qPCR及免疫组化检测。

2.2 干预 雌、孕激素联合给药造模完成后，当归芍药散加味方组按含生药量1 g／（kg·d）予当归芍药散加味方药液灌胃；乳消Ⅲ胶囊组按0.7g／（kg·d）予乳消Ⅲ胶囊药液灌胃；模型2组与空白组予等体积生理盐水灌胃，均连续灌胃30 d。实验结束后以上32只大鼠无死亡、均存活。

2.3 取材 大鼠灌胃30 d后，禁食24 h。运用腹腔注射麻醉药的方法，根据每公斤体质量注射1 mL的10%水合氯醛后，处死大鼠，游标卡尺测第2对乳头高度和直径，然后剥离大鼠第2对乳房，用肉眼观察大鼠乳腺组织的外表、称重；最后用10%福尔马林溶液固定，待做病理学观察、RT-qPCR检测及免疫组化的检测。

2.4 病理学观察 常规取材乳腺组织经固定、脱水、石蜡包埋切片及HE染色之后，用光学显微镜观察大鼠乳腺组织切片的组织学变化。

2.5 RT-qPCR检测乳腺组织Let-7a mRNA表达

提取乳腺组织的总RNA并进行质检，按说明书要求进行RT反应：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，混匀后按37℃60 min，85℃5 s在PCR仪上进 行反应。反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，PCR引物F 0.8 μL，通用引物R 0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，RT溶液2 μL，RNase Free dH2O 6 μL，混匀后按95℃预变性30 s，95℃变性3 s，60℃退火延伸30 s，循环40次并建立溶解曲线。扩增结束后，根据在每次循环延伸处收集荧光信号，分析整理数据。

2.6 免疫组化法检测p-ERK蛋白表达 采用免疫组化法S-P法检测乳腺上皮组织p-ERK蛋白的表达。先切取部分大鼠乳腺组织进行脱蜡水化，再加入20 g／mL的蛋白酶K消化20 min，接着用3%H2O2进行阻断，最后倒入p-ERK一抗过夜处理，按试剂盒步骤操作，DAB显色，苏木素复染，干燥封片。

2.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行处理分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用方差分析。

3 结 果

3.1 5组大鼠乳头直径、高度比较 见表1。

表1 5组大鼠乳头直径、高度比较（±s）mm

表1 5组大鼠乳头直径、高度比较（±s）mm

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型2组比较，2）P＜0.01。

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3.2 5组大鼠乳腺组织形态学变化 空白组大鼠乳房未见到明显的乳腺导管扩张，腺小叶和腺泡结构均正常。模型1组和模型2组小叶、腺泡、导管的数量明显增多，腺泡之间排列紧密甚至部分出现相互融合，腺泡腔增大，导管管腔扩张，管腔内可见脱落的上皮细胞分泌物，导管上皮增生，间质充血，水肿，小叶间及导管周围纤维结缔组织增生。乳消Ⅲ胶囊组少量的乳腺导管上皮增生但无明显乳头形成，腺泡上皮轻度增生但未充满囊腔，未见囊泡。当归芍药散加味方组接近空白组。见图1。

图1 5组大鼠乳腺组织HE染色图（×100）

3.3 5组大鼠乳腺组织Let-7a mRNA表达比较见表2。

表2 5组大鼠乳腺组织Let-7a mRNA表达比较（±s）

表2 5组大鼠乳腺组织Let-7a mRNA表达比较（±s）

注：与空白照组比较，1）P＜0.05；与模型2组比较，2）P＜0.05；与乳消Ⅲ胶囊组比较，3）P＜0.05。

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3.4 5组大鼠乳腺组织p-ERK蛋白表达比较 见表3、图2。

图2 5组大鼠乳腺组织免疫组化染色图（×100）

表3 5组大鼠乳腺组织p-ERK蛋白表达比较（±s）

表3 5组大鼠乳腺组织p-ERK蛋白表达比较（±s）

注：与空白照组比较，1）P＜0.01；与模型2组比较，2）P＜0.01；与乳消Ⅲ胶囊组比较，3）P＜0.01。

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4 讨 论

乳腺增生病是一种对激素依赖性很大的疾病，其中雌、孕激素的比例失衡是引发本病发生的关键。运用雌孕激素联合造模的方法，因其重复性良好，稳定可靠，又操作便捷，是目前动物实验研究中最常用的造模方法［2］。本实验即采用雌、孕激素联合造模方法，同时也考虑大鼠乳腺组织在停止造模后是否存在自愈倾向，为此本研究设计了模型1组和模型2组，模型1组在停止造模后随即处死，取下乳腺组织，与实验结束后模型2组比较是否存在自愈倾向。本实验结果显示，各实验组大鼠与空白组比较，大鼠乳头直径和乳头高度均明显增大（P＜0.01），光镜下观察各实验组大鼠乳腺组织，均发生显著的增生性改变。且模型1组和模型2组在乳头直径、乳头高度及乳腺组织形态学方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明本实验造模成功，且停止雌孕激素造模后，大鼠乳腺增生无自愈倾向。

Let-7a最早由JOHNSON等发现在肺癌组织中出现了表达，他们通过实验证实，Let-7a具有抑制肺癌肿瘤细胞生长的作用［3］。随后AKAO等［4］在大肠癌实验中也发现Let-7a的表达，并有抑制肠癌细胞 生 长 的 作 用，SAMPSON等［5］在 对 伯 基 特 淋 巴 瘤的实验研究中也发现Let-7a具有抑制伯基特淋巴瘤生长的作用。同样在乳腺癌的研究中，学者们运用miRNA芯片技术也证实Let-7a亦存在异常表达。另外，相关研究也表明Let-7家族类miRNAs都可能具有肿瘤抑制作用，是一种潜在的抑制癌基因家族，其中Let-7a／b／c这三个基因表达与乳腺癌预后 关 系 密 切［6］。张 硕 等［7］也 发 现，Let-7家 族 成 员Let-7c-5p能够抑制乳腺癌中长链非编码RNA（lncRNA）浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1），通过提高Let-7c-5p的表达会抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，说明Let-7c-5p的表达量具有抑癌作用。但目前相关研究中关于Let-7a对乳腺增生病的影响研究相对较少。本实验结果显示，各实验组大鼠乳腺组织Let-7a基因表达量均较空白组明显降低（P＜0.05），说明乳腺增生病发生与Let-7a基因表达下降有关；在治疗组中，当归芍药散加味方组和乳消Ⅲ胶囊组大鼠乳腺组织Let-7a基因表达量均较模型2组升高（P＜0.05），当归芍药散加味方组大鼠Let-7a基因表达量较乳消Ⅲ胶囊组提高（P＜0.05），提示通过中药可提高大鼠乳腺组织Let-7a基因的表达，降低乳腺上皮细胞增殖活跃性，改善大鼠乳腺组织的增生状态，同时当归芍药散加味方疗效优于乳消Ⅲ胶囊组。

ERK信号通路是目前已知与细胞生长、分化、增殖密切相关的转导途径，而p-ERK蛋白是ERK信号通路上的重要蛋白，其是ERK磷酸化后存在的活性表现形式。p-ERK蛋白可以干扰ERK信号通路的正常转导过程、调节细胞周期变化，进一步影响细胞的正常增殖、分化及凋亡的过程。正常细胞的癌变过程与p-ERK蛋白干扰ERK信号通路的转导过程出现异常有着因果联系。当p-ERK蛋白进入到细胞核中参与转录调节时，激发癌细胞的活性，从而使得正常细胞转化为恶性［8］，当p-ERK蛋白出现表达过度或者异常的时候，可加快细胞的增殖和分化。因此通过干预p-ERK蛋白的表达强度，可以影响ERK信号通路的转导过程，进一步对细胞周期起到调节、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，阻断乳腺增生的发展及癌变的发生。本研究结果显示，实验组大鼠乳腺组织p-ERK蛋白表达量均高于空白组，这表明当p-ERK蛋白表达增强时可引发乳腺增生病的发生；模型2组的大鼠乳腺组织p-ERK蛋白表达量高于乳消Ⅲ胶囊组和当归芍药散加味方组，当归芍药散加味方组大鼠p-ERK蛋白表达量低于乳消Ⅲ胶囊组。提示通过中药干预影响p-ERK蛋白激活，进而抑制细胞增殖、分化，促进细胞凋亡，改善乳腺组织增生状态，这对于防止乳腺增生的发展及癌前病变具有重要意义，且当归芍药散加味方组疗效优于乳消Ⅲ胶囊组。

综上，乳腺增生模型大鼠乳腺组织中出现Let-7a基因与p-ERK蛋白的异常表达，当Let-7a基因出现低表达时，p-ERK蛋白则表现出高表达，说明乳腺增生病的发生与Let-7a和p-ERK的异常表达相关。当归芍药散加味方可以减轻乳腺增生模型大鼠乳腺组织增生程度，其作用机理可能与促进Let-7a基因表达、降低p-ERK表达，抑制乳腺组织细胞增殖的活性从而达到改善乳腺组织增生的状态，实现治疗乳腺增生病的目的。本次研究通过探讨当归芍药散加味方治疗乳腺增生病可能的作用机理，为研发中药制剂治疗乳腺增生病提供一定的现实意义。