UPLC-MS／MS法同时测定参术散中的4种成分

郑 东，陈雪梅，白晨龙，李 煌

（1.厦门市中医院，福建 厦门361001；2.福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

参术散是厦门中医院研制的院内制剂（闽药制字Z04202028），具有补脾胃、益肺气的功效，临床上主要用于气短咳嗽、脾胃虚弱、食少便溏及消瘦乏力等［1］。该处方是在八珍糕的基础上，结合闽南人的体质特点遣方用药［2］。目前在临床中发现其对脾虚湿盛型糖尿病、肿瘤放化疗后、消化系统疾病和老年营养不良患者效果确切。本制剂药味众多，主要 含 有 萜 苷 类［3］、黄 酮 类［4］、酚 酸 类［5］和 多 糖 类［6-7］等，目前，该院内制剂的质量标准较为简单，尚未见对制剂的化学成分同时定量的方法及相关研究。近年来，随着2020版《中华人共和国药典》的颁布，中药质量标准要求越来越高，同时测定中药复方制剂中的多种成分含量，有利于对制剂进行更好的质量控制，提升用药安全性和有效性。本实验首次建立UPLC-MS／MS法同时测定参术散中绿原酸、甘草苷、党参炔苷和甘草酸铵4种成分含量的方法，并采用电喷雾电离源（ESI）、正负离子扫描方式以及多反应监测（MRM）模式，该方法快速、准确，可为该制剂质量控制提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器SCIEX QTRAP 4500三重四极杆质谱（SCI EX公司）；Nexera X2超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XS105DU型十万分之一分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；乙腈、甲酸、乙酸铵（色谱纯，德国Merck公司），Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司），其余试剂为分析纯。

1.2 试药 参术散（厦门市中医院制备，批号：171027、181214、190515，规格50 g）。对照品甘草苷（111610-201005）、甘草酸铵（110731-201720）和绿原酸（110753-200413）购自中国药品生物制品检定院，齐墩果酸（HAO820KA14）和党参炔苷（MUST-1706 2207）购自成都曼斯特生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 选用Shim-pack XR-ODSⅢ（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）色谱柱，流动相以0.1%甲酸5 mmol／L乙酸铵水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0～2.0 min，10%B→90%B；2.0～5.0 min，90%B；5.0～5.5 min，90%B→10%B；5.0～8.0 min，10%B；流速0.30 mL／min；柱温40℃；进样量5 μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源，在正负离子模式下扫描，毛细管电压为4.5 kV，脱溶剂温度500℃、气流为氮气800 L／h，锥孔气流：氮气150 L／h，离子源温度：550℃，二级锥孔萃取电压：3.00 V，碰撞气体：氩气，扫描方式为多反应监测（MRM）模式，4种成分各自的质谱分析参数如表1所示。在上述的色谱质谱条件下检测，得到4个成分的MRM图，如图1所示。

表1 4种成分的保留时间及质谱分析参数

图1 对照品UPLC-MS／MS色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 称取2.0 g参术散样品至具塞的锥形瓶中，加入100 mL 60%乙醇水溶液，于80℃水浴2 h，冷却后补足重量，过滤，取25 mL滤液至150 mL平底烧瓶中，至45℃水浴旋蒸至干，加入5 mL 0.1%甲酸-10%甲醇水溶液，涡旋溶解，转移至15 mL离心管中，10 000 r／min离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得参术散供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密称定绿原酸、甘草苷、党参炔苷和甘草酸铵的对照品，加入甲醇制成质量浓度分别为1.310、1.250、1.000、1.060 mg／mL的单一对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液适量，置同一容量瓶中，加入20%甲醇水至刻度，即得4个化合物质量浓度均为10 μg／mL的混合对照品储备液，其他不同质量浓度的对照品混合溶液由混合对照品储备液逐级稀释，即得。

2.3 UPLC-MS／MS定量方法学考察

2.3.1 线性和范围 取“2.2.2”项下各对照品储备液适量，用20%甲醇稀释配制系列梯度浓度的对照品混合溶液，按照“2.1”项下的色谱、质谱条件，进样分析。以定量离子峰面积（y）为纵坐标，对照品溶液质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数（r），并以信噪比（S／N）＝10为定量下限（LOQ），结果见表2。

表2 线性方程、线性范围、相关系数及定量下限

2.3.2 精密度试验 取0.10 μg／mL的混合对照品溶液，连续进样6次进行峰面积测定（测定条件同“2.1”项下），测定结果显示，绿原酸、甘草苷、党参炔苷和甘草酸铵4种成分的峰面积RSD分别为1.9%、0.98%、1.5%、2.2%，表明研究所用仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取参术散样品（批号：190515），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，共记录6个时间点的图谱。结果显示，样品中绿原酸、甘草苷、党参炔苷和甘草酸铵4个峰保留时间的RSD分别为1.01%、0.98%、1.65%、1.14%，均小于3.0%，峰面积的RSD分别为1.23%、1.57%、1.08%、0.92%，均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内相对稳定，能满足定量分析要求。

2.3.4 重复性试验 精密称取参术散样品（批号：190515），取参术散样品（批号：190515）进样测定，制备方法同“2.2.1”项下，条件同“2.1”项下，结果绿原酸、甘草苷、党参炔苷和甘草酸铵的平均含量分别 为16.10、19.75、155.00、52.40 μg／g，RSD分 别 为1.7%、1.4%、2.6%、2.3%，表明本方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取6份参术散样品（批号：190515），每份约1.0 g，分别加入折算质量为本底量100%的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下方法制备供试溶液，进行加样回收试验，记录峰面积并计算各成分的加样回收率。结果显示，4种成分的回收率为91.05%～100.38%，平均回收率为94.40%～99.45%，RSD为1.04%～2.82%（n＝6），表明该方法的准确度较好（见表3）。

表3 4种成分的回收率及RSD（n＝6）

2.3.6 各批次成分含量测定 精密称取参术散样品（每批样品取2份），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下条件测定峰面积，根据标准曲线计算其含量，结果见表4。结果显示，3批参术散的4个化学成分含量虽然有一定的差异，但总体上差异不大，且3批样品生产年份（分别为2017、2018和2019年）也不同，说明该制剂质量比较稳定的。

表4 各批次成分含量测定结果（n＝2） μg／g

3 讨 论

3.1 参术散组方 参术散原方出自《太平惠民和剂局方》，有益气健脾、渗湿止泻功效，主治脾虚湿盛证。在本研究中，参术散是由党参、茯苓、白术等共计11味中药组成［8］，其中，党参、白术、茯苓三者为君药，并配伍山药、莲子，以助君药发挥益气健脾、渗湿止泻之功效；白扁豆、薏苡仁二者为臣药，增强其健脾化湿作用；佐药砂仁醒脾和胃、行气化滞；甘草健脾和中、调和诸药，桔梗则宣肺利气、通调水道，两者共为佐使。全方补中气、渗湿浊、行气滞，使脾气健运，湿邪得去，则诸症自除。与《中华人民共和国药典》所收载的参苓白术散［9］的处方成分有所不同，该院内制剂用党参替换了人参，保证临床药效的同时降低了成本［10］；另外，还新增一味陈皮，可加强理气化痰之功效。现该制剂作为厦门中医院的院内制剂，疗效明确，相关研究主要是临床方面的，质量控制方面较少，故本研究建立同时测定参术散成分含量的UPLC-MS／MS方法有助于控制其质量。

3.2 指标成分的选择 参术散中，党参是一味君药，而党参炔苷是《中华人民共和国药典》中党参质量评价的重要指标［8］，许多研究也选择其作为党参指标性成分［11-12］，具有补中益气、健脾益肺以及抗氧化作用。另外，党参、茯苓、白术中都含有绿原酸，其具 有 提 高 免 疫 力 的 作 用［13-15］，但 稳 定 性 较 差［16］，需注意储存条件。甘草补中益气，能调和诸药，含有甘草苷、甘草酸铵，具有润肺止咳作用［17］，甘草苷还有抗溃疡作用［18］。因此，本研究以上述4种成分作为研究对象进行初步考察，以期为参术散质控提供参考。

3.3 色谱条件的选择 在实验条件摸索中，我们分别考察Thermo C18（2.1 mm×150 mm，2 μm）、Shimpack XR-ODSⅢ色谱柱（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）、Thermo C18（2.1 mm×150 mm，2 μm）和Kinnetex C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）对参术散4个成分的分离效果，结果表明Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）的分离度和灵敏度比其他色谱柱高。另外，在流动相选择中，考察了甲醇和乙腈作为流动相时的洗脱情况，发现前者洗脱能力弱，个别成分洗脱差；同时，为了提高离子响应并改善峰型，又在流动相中添加甲酸和乙酸铵，发现当甲酸体积分数为0.1%、乙酸铵水溶液浓度为5 mmol／L时，可达到提高灵敏度、改善峰型的作用。因此，0.1%甲酸5 mmol／L乙酸铵水溶液-乙腈为最佳，短时间内（8 min）即可实现了参术散4个成分的分离定量，单针样品所消耗的流动相不足3 mL，明显优于高效液相色谱法。

3.4 质谱条件的选择 本实验在探索离子扫描模式时，考察正、负离子模式下4种成分的响应情况，结果显示，甘草酸铵在正离子模式下响应较高，而甘草苷、绿原酸、党参炔苷则是负离子模式响应较好，因此用正负离子扫描。通过优化MRM条件，选择定量最佳的离子对。施加一定的电压使母离子发生碰撞后解离，从而获得子离子，定性时选择两对高离子丰度、低基线噪声的离子，定量则选择最高离子丰度的离子对。通过优化碰撞能量和源内碎裂电压，使所选的子离子达到最佳丰度及比例。

本实验研究了3批参术散，4种化合物含量虽存在一定差异，但波动不大，说明该制剂质量比较稳定，但本研究仅测定了3批样品，后续可扩大样本量，并对其他有效成分进行更深入的研究。本实验建立的超高效液相色谱串联质谱法，分析快速、准确，可同时测定参术散4个成分含量，为综合评价参术散质量提供参考。