THAP8基因可被HIF-1a上调并促进肺癌细胞活力、克隆形成和侵袭

刘顺莲,宁贻崇,刘凯丽,陈思文,周 琳,李美玲,张 晴,周建林*

(1.湖南师范大学生命科学学院,中国湖南长沙410081;2.湖南师范大学附属中学博才实验中学,中国湖南长沙410205;3.崇左市人民医院检验科,中国广西崇左532200)

肺癌是一种常见的恶性肿瘤。按组织学类型,肺癌可以分为非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC),其中NSCLC占85%,而NSCLC又可以分为肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAC)和肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)[1]。肺癌是世界上发病率和死亡率最高的一种恶性肿瘤[2～3]。据统计,我国2015年新发恶性肿瘤392.9万例,癌症死亡病例233.8万例,其中肺癌的新发病例和死亡病例最高,分别占总的新发恶性肿瘤病例和癌症死亡病例的20.03%(78.7万)和26.99%(63.1万)[3]。近年来,随着分子生物学的发展,靶向药物的研发取得了较大进展,靶向药物治疗显著提高了肺癌患者的生存期和生活质量[4]。但是,现有靶向药物仍然存在耐药性和靶点少等问题,因此亟需进一步研究肺癌的发病机制,发掘新的靶点。

死亡相关蛋白(Thanatos-associated proteins,THAP)家族因多肽链的氨基末端都有1个在进化上高度保守的THAP锌指结构域而得名,该结构域具有DNA结合活性[5]。另外,THAP结构域的下游还存在1个coiled coil结构域,可以介导同源或异源二聚体的形成[6]。目前,已发现12个THAP家族成员(THAP0～11)[6],其中大部分成员与细胞周期、凋亡和癌症相关。例如:THAP5在黑色素瘤细胞中起促凋亡的作用[7];THAP7在肺癌组织中高表达,并促进肺癌细胞的增殖[8]。THAP8的功能尚不清楚,目前仅有1篇关于THAP8的报道,该研究发现THAP8在卵巢癌组织中高表达[9]。本文旨在探讨THAP8基因在肺癌组织中的表达、转录调控和作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

RNA提取试剂盒购自上海美吉生物医药科技有限公司,反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,荧光定量PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司,荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司,铺有Matrigel胶的Transwell小室购自美国Corning公司,THAP8抗体购自美国Abgent公司,缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)抗体、ACTB抗体和二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司,胎牛血清购买自德国Serana公司,RPMI1640和DMEM培养基购买自美国Gibco公司,转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司,其他常规生化试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 临床样本

肺癌组织和癌旁组织的新鲜样本来自中南大学湘雅二医院,样本的临床病理资料参见文献[10]。

1.3 细胞系和细胞培养

正常肺细胞系Beas-2B、6种人肺癌细胞系(95-D、A549、H446、H358、H460 和 H1437)及正常的人类肾上皮细胞HEK293均通过上海钰博生物科技公司购自美国ATCC公司。细胞培养按ATCC公司提供的说明书进行。

1.4 质粒

荧光素酶(luc)报告基因载体pTAL-luc和β-半乳糖苷酶(lacZ)报告基因载体pCMV-lacZ均购自美国Clontech公司。HIF-1α的表达质粒HAHIF1A为 Kondo等[11]构建(Addgene Plasmid No.18949)。野生型和突变型(野生型中的4个ACGTG序列均突变为AAAAG)启动子序列(192 bp)由上海生工生物工程股份有限公司合成并克隆到pTAL-luc中,构建的质粒分别命名为THAP8-HRE-luc和 THAP8-mHRE-luc。

1.5 质粒转染和荧光素酶活性分析

HEK293细胞培养在24孔板中,每个孔分别转染等量的 pCMV-lacZ(0.2 μg)、THAP8-HRE-luc/THAP8-mHRE-luc(0.2 μg)以及梯度增加的HAHIF1A(0 μg、0.1 μg、0.2 μg 和 0.4 μg)。每个孔转染的质粒总量为0.8 μg,不足部分用空载体pcDNA3.1质粒补充。重复3次。转染24 h后收获并裂解细胞,按文献[12]的方法测定半乳糖苷酶活性和荧光素酶活性,并计算荧光素酶活性/半乳糖苷酶活性的比值。

1.6 细胞功能分析

按照文献[13]的方法进行MTT分析、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell小室侵袭实验,所有实验均重复3次。

1.7 RNA提取、反转录和荧光定量PCR

RNA提取和反转录按说明书进行操作。以得到的cDNA为模板,采用SYBR Green试剂盒配制反应体系,在ABI 7900 thermocycler(美国ThermoFisher公司)上进行PCR反应。以18S基因作为内参基因,其引物序列:5′-CGGCGACGACCCATTCGAAC-3′和 5′-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3′,THAP8 基因的引物序列:5′-CCCTGCGCCAACTCCTGAGC-3′和 5′-TGTGGCAGGTGCAGGGTCCT-3′。每组设4个平行反应。PCR程序为95℃预变性5 min,然后进行40个循环,每个循环包括95℃变性30 s,58℃退火30 s,72°C延伸30 s。

1.8 蛋白质免疫印迹(Western-blot)

细胞裂解、电泳和Western-blot按照文献[13]的方法进行。

1.9 慢病毒感染和稳定细胞筛选

THAP8 shRNA(short hairpin RNA)慢病毒和阴性对照慢病毒(negative control,NC)购自广州复能基因有限公司,其干扰靶点序列见表1。HIF-1α过表达慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。慢病毒感染和稳定细胞株构建按照文献[13]的方法进行。

表1 THAP8 shRNA慢病毒和阴性对照慢病毒的干扰靶点序列Table 1 The target sequence of each THAP8 shRNA lentivirus and negative control lentivirus

1.10 统计学分析

利用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 7进行数据统计并绘图。用Student’s t-检验分析两组间的差异,用P值表示显著性水平,“*”表示P≤0.05,“**”表示P≤0.01。每组数据都根据 3个或以上的独立实验获得平均值±标准差(±s),当P<0.05时,结果才被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 THAP8在肺癌组织中的表达高于正常肺组织

首先,我们通过UALCAN软件[14](http://ualcan.path.uab.edu)分析了TCGA数据库中的RNA-seq数据,发现THAP8在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达显著高于正常肺组织(图1A)。然后,我们进一步分析了Oncomine肿瘤芯片数据库[15]中的数据,其结果(图1B)与TCGA数据库的分析结果一致。为了验证数据库分析的结果,用荧光定量PCR技术分析了22对人肺癌(其中,腺癌和鳞癌各11对)及癌旁组织样本,结果表明:肺癌组织中THAP8的mRNA表达水平显著高于癌旁组织(图1C)。Western-blot结果表明:THAP8蛋白在肺癌细胞系中的表达水平明显高于正常肺细胞系Beas-2B;在6种肺癌细胞系中,H460和H1437的THAP8蛋白表达水平最高,而A549细胞系的THAP8蛋白表达水平最低(图1D～G)。

图1 THAP8在肺癌组织中显著高表达(A～C)在TCGA数据库(A)、Oncomine数据库(B)和临床样本(C)中分析THAP8 mRNA水平;(D～F)3次重复的免疫印迹实验;(G)3次免疫印迹实验的THAP8条带灰度分析,与Beas-2B相比,ns表示没有显著性差异,*表示P≤0.05,**表示P≤0.01。Fig.1 THAP8 is overexpressed in the lung cancer tissues(A～C)Analysis of THAP8 mRNA levels in TCGA database(A),Oncomine database(B)and lung cancer and non-cancerous tissues(C);(D～F)Three repeats of Western-blot experiments;(G)The relative band intensity(mean±standard deviation)of THAP8 protein normalized against that of ACTB.ns:Non-significance,*:P≤0.05,and**:P≤0.01 vs.Beas-2B.

2.2 HIF-1α调控THAP8基因的表达

2.2.1 THAP8基因启动子上存在HIF-1α的结合位点

JASPAR软件(http://jaspar.genereg.net)分析显示,THAP8基因启动子区含有4个缺氧诱导元件(hypoxia response element,HRE;ACGTG)(图2A),因此我们推测转录因子HIF-1能调控THAP8基因转录。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成,其中HIF-1α受缺氧诱导。我们将上述序列及其突变序列(4个ACGTG位点均突变为AAAAG)分别克隆到荧光素酶报告载体pTAL-luc,成功构建THAP8-HRE-luc和THAP8-mHRE-luc的报告质粒。随后,将THAP8-HRE-luc或THAP8-mHRE-luc分别与HIF-1α表达质粒HA-HIF1A共转染到HEK293细胞中,24 h后测定荧光素酶活性,结果表明:随着HA-HIF1A质粒量的增加,THAP8-HRE-luc荧光素酶活性明显增强,而HA-HIF1A的表达对于突变的THAP8基因启动子活性则没有显著的增强作用(图2B),这说明:HIF-1α可通过结合到THAP8基因启动子上的HRE位点,促进THAP8基因的转录。

2.2.2 HIF-1α促进THAP8基因的表达

CoCl2可以诱导细胞缺氧从而提高HIF-1α蛋白的表达[16]。我们按照文献[16]的方法,用不同浓度的CoCl2处理Beas-2B细胞24 h,发现随着CoCl2浓度的增加,HIF-1α蛋白的表达水平逐渐升高,且THAP8蛋白的表达水平也升高(图2C),说明HIF-1α能促进THAP8基因的表达。另外,我们将过表达HIF-1α的慢病毒和空载体慢病毒分别感染Beas-2B细胞,72 h之后进行Western-blot分析。结果表明:与未感染慢病毒的细胞(mock组)相比,感染空载体慢病毒的细胞(vector组)中HIF-1α和THAP8蛋白的表达水平都没有明显变化,而感染HIF-1α过表达慢病毒(HIF-1α组)之后,细胞中HIF-1α和THAP8蛋白的表达水平显著升高(图2D),这进一步说明HIF-1α促进THAP8基因的表达。

图2 HIF-1α调控THAP8基因的表达(A)THAP8启动子序列,缺氧诱导元件用下划线标注;(B)将等量的pCMV-lacZ(0.2 μg)和THAP8-HRE-luc/THAP8-mHRE-luc(0.2 μg)以及梯度增加的 HA-HIF1A(0 μg、0.1 μg、0.2 μg 和 0.4 μg)转染 HEK293 细胞,24 h 后测定荧光素酶/β-半乳糖苷酶的相对活性;(C)CoCl2处理Beas-2B细胞增强HIF-1α和THAP8的表达;(D)未感染慢病毒组(mock)、空载体慢病毒感染组(vector)和HIF-1α过表达慢病毒组(HIF-1α)的Western-blot分析。Fig.2 HIF-1α up-regulates the expression of THAP8 gene(A)The sequence of THAP8 promoter.The hypoxia response elements(HREs)are underlined;(B)HEK293 cells were co-transfected with pCMV-lacZ(0.2 μg),THAP8-HRE-luc/THAP8-mHRE-luc(0.2 μg)and increasing amount of HA-HIF1A(0 μg,0.1 μg,0.2 μg and 0.4 μg).At 24 h post-transfection,the cells were lysed to measure the activities of luciferase and β-galactosidase.The relative luciferase activities were normalized according to β-galactosidase activities;(C)Expression of HIF-1α and THAP8 in Beas-2B induced by CoCl2treatment;(D)Western-blot analysis of mock group(the uninfected Beas-2B cells),vector group(the Beas-2B cells infected with empty vector lentivirus)and HIF-1α group(the Beas-2B cells infected with HIF-1α-overexpressing lentivirus).

2.3 干扰THAP8抑制肺癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭

2.3.1 干扰THAP8细胞系的构建

我们构建了4个THAP8 shRNA的表达载体,并将其包装成慢病毒颗粒(表1);在95-D细胞中进行预实验以检测干扰效果,结果显示sh32和sh33这两个慢病毒的干扰效果最佳(图3A),因此在后续实验中采用这两个慢病毒对THAP8进行干扰。选取THAP8表达水平相对较高的H460和H1437细胞系做干扰实验,并构建稳定细胞株。Western-blot证实肺癌细胞系H460和H1437的干扰细胞株构建成功(图3B～C)。

图3 干扰THAP8的稳定细胞系的构建(A)表达阴性对照shRNA(NC)或THAP8 shRNA(sh31、sh32、sh33和sh34)的慢病毒分别感染95-D细胞,72 h后收获细胞进行免疫印迹;(B～C)表达NC、sh32和sh33的慢病毒分别感染H460和H1437细胞后经潮霉素筛选获得的稳定细胞株的免疫印迹结果。Mock表示未感染慢病毒的细胞。Fig.3 Generation of cell lines stably expressing THAP8 shRNAs(A)The 95-D cells were infected with lentiviral particles expressing scramble shRNA(NC)or THAP8 shRNA(sh31,sh32,sh33,sh34),and were harvested for Western-blot at 72 h after transduction;(B～C)The sh32 and sh33 lentiviral particles were selected to infect H460 and H1437 cells.After infection,the cells were selected for stable cells with hygromycin and subjected for Western-blot.Mock:The cells without lentivirus infection.

2.3.2 干扰THAP8抑制肺癌细胞活力

在构建了干扰THAP8的稳定细胞株后,采用MTT法探讨干扰THAP8对肺癌细胞活力的影响。结果表明:与阴性对照NC组相比,从3 d后开始,干扰THAP8的H460细胞的活力显著降低(图4A),而在5 d后干扰THAP8的H1437细胞的活力才具有显著差异(图4B)。这些结果说明:干扰THAP8能抑制H460和H1437的细胞活力,但其对H460细胞活力的影响大于H1437。

图4 干扰THAP8对肺癌细胞H460(A)和H1437(B)活力的影响sh32组和NC组比较,*:P≤0.05,**:P≤0.01;sh33组和NC组比较,#:P≤0.05,##:P≤0.01。Fig.4 The influence of THAP8 knockdown on viability of lung cancer cells H460(A)and H1437(B)*:P≤0.05 and**:P≤0.01,sh32 vs.NC;#:P≤0.05 and##:P≤0.01,sh33 vs.NC.

2.3.3 干扰THAP8抑制肺癌细胞的克隆形成能力

细胞克隆形成实验结果表明,与对照NC组相比,干扰THAP8的H460和H1437细胞的群落显著减少(图5),说明THAP8促进肺癌细胞的克隆形成。

图5 干扰THAP8对肺癌细胞克隆形成能力的影响3次克隆形成重复实验的代表性图片(A～B)和克隆数的平均值(C～D);**表示与NC组相比,差异极显著(P≤0.01)。Fig.5 The influence of THAP8 knockdown on lung cancer cell colony formationRepresentative images of colony(A～B)and the average colony numbers from three repeats of experiments(C～D).**:P≤0.01 vs.NC.

2.3.4 干扰THAP8抑制肺癌细胞的侵袭能力

Transwell侵袭实验结果表明,与对照NC组相比,干扰THAP8的H460和H1437的侵袭细胞数量显著降低(图6),说明THAP8促进肺癌细胞的侵袭。

图6 干扰THAP8对肺癌细胞侵袭能力的影响3次Transwell侵袭重复实验的代表性图片(A～B)和统计分析结果(C～D);**表示与NC组相比,差异极显著(P≤0.01)。Fig.6 The influence of THAP8 knockdown on lung cancer cell invasionRepresentative images(A～B)and statistical analysis(C～D)of invaded cells in the Transwell invasion assay.**:P≤0.01 vs.NC.

3 讨论

本文通过癌症数据库分析和临床样本分析均发现,THAP8在肺癌组织中异常高表达(图1)。这个结果与王冠等[9]的结果类似,他们发现THAP8在卵巢癌组织的表达显著高于正常卵巢组织。为了研究THAP8在肺癌细胞中的功能,在H460和H1437细胞中干扰THAP8基因,并采用细胞活力实验(MTT法)、划痕实验、克隆形成实验和侵袭实验等探究了THAP8对肺癌细胞生物学行为的影响。研究结果表明:干扰THAP8基因之后,H460和H1437细胞的活力、克隆形成和侵袭能力均显著下降(图4～6),但其对细胞迁移没有显著影响(结果未显示)。这些结果提示THAP8可能是一个癌基因。

此外,本研究发现THAP8基因启动子上有4个HRE位点(图2A),荧光素酶实验证实HIF-1α可以增强野生型THAP8启动子活性,但对突变的THAP8启动子(其4个HRE位点被突变)没有明显的影响(图2B),推断HIF-1α可以结合到THAP8基因的启动子上,并促进THAP8基因的转录。进一步采用CoCl2诱导处理,使细胞处于缺氧状态,发现HIF-1α蛋白能调控THAP8基因的表达(图2C)。而且,在Beas-2B细胞中过表达HIF-1α可以促进THAP8蛋白的表达(图2D)。

缺氧是实体肿瘤中普遍存在的特征,与肿瘤的转移密切相关[17]。缺氧会激活HIF-1α的表达,激活的HIF-1α作为转录因子发挥作用,调控血管生成和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等相关基因的表达,从而促进肿瘤的EMT和转移[17～19]。HIF-1α已被证实可以用作治疗癌症的一个靶点[19]。本文发现HIF-1α可以促进THAP8的转录,而THAP8可以促进肺癌细胞的转移,提示HIF-1α可能通过THAP8发挥作用。

综上所述,本研究发现THAP8是一个新的癌基因,其可以显著促进肺癌细胞的克隆形成和侵袭,并且其表达受到HIF-1α蛋白的调控。这些结果说明THAP8基因可以作为一个潜在的肺癌治疗靶点和预后标志,可为癌症的诊断、预后判断和抗肿瘤药物开发提供新思路。

致谢:本文所用的肺癌组织样本由中南大学湘雅二医院胸外科卿蓓博士提供,在此表示感谢！