腺病毒肺炎患儿外周血单个核细胞中转录因子Foxp3 mRNA的表达变化*

张伦敏，张 翔

(遵义医科大学第三附属医院/遵义市第一人民医院儿科，贵州 遵义 563003)

腺病毒(adenovius)肺炎占儿童病毒肺炎的4%～10%，是婴幼儿肺炎中最严重的类型之一。重症腺病毒肺炎患者发热时间长、临床表现重，易发生多系统并发症，病死率较高，后遗症较多[1]。自20世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人类腺病毒根据物理、化学、生物学性质分为A～G 7个亚群，52个血清型。3、7型腺病毒为腺病毒肺炎的主要病原，7型更易导致重症肺炎[2-3]，也有55型可以引起儿童肺炎的文献报道[4]。目前，腺病毒肺炎发病机制尚未完全阐明，CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)是近年来在人和鼠体内发现的具有显著免疫抑制作用的CD4+T淋巴细胞亚群，已有研究证明，Treg主要通过细胞与细胞接触或通过分泌细胞因子在机体抗病毒免疫反应中起着非常重要的作用[5-7]，Foxp3是CD4+CD25+Treg的特异性转录因子，对CD4+CD25+Treg的发育成熟和发挥免疫抑制功能具有重要作用，其水平的高低可以反映CD4+CD25+Treg功能状态。本研究通过检测腺病毒肺炎患儿外周血特异性转录因子Foxp3的表达水平，探讨其在儿童腺病毒肺炎中的免疫致病机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年12月本科收治的30例住院患儿作为病例组，其中男17例，女13例；年龄3个月至12岁，平均(5.2±2.0)岁。选取同期在本院健康体检儿童30例作为对照组，其中男18例，女12例；年龄1～11岁，平均(6.2±3.1)岁。2组研究对象年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)符合《儿童腺病毒肺炎诊断标准》[8]；(2)病原学检测为腺病毒；(3)治疗前1个月未使用影响免疫系统功能类药物。排除标准：(1)患有其他自身免疫系统疾病；(2)合并严重肝、心、肾疾病及恶性肿瘤疾病。

1.2试剂与仪器 Trizol试剂(Invitrogen公司)，人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司)，聚合酶链反应(PCR)仪(Eppendorf公司)，核酸蛋白微量分析仪(Thermo公司)，逆转录反应体系试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)，β-actin、Foxp3引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。

表1 检测基因与对应的引物序列

1.3方法 采集患儿及正常健康儿童空腹外周血3 mL，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA样品2 μL用核酸微量分析仪检测其RNA的浓度及在260 nm和280 nm下的光密度比值(OD260/280值)进行纯度鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。逆转录条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。 qRT-PCR反应条件：变性(95 ℃，3 min)；退火(95 ℃，5 s)；延伸(60 ℃，30 s)；循环(40个周期)。各样本相对表达量采用国际通用的相对定量法(2-ΔΔCT法)进行统计分析，以Ct值为统计参数依次计算下列数据：ΔΔCt=(Ct目的-Ct内参)病例组-(Ct目的-Ct内参)对照组，目的基因相对于某基因的表达量=2-ΔΔCT。

2 结 果

2.1部分标本电泳图、扩增及熔解曲线 Foxp3 mRNA部分标本qRT-PCR扩增产物电泳图(图1)。β-actin、Foxp3 mRNA基因的qRT-PCR扩增产物单一，熔解曲线未见杂峰，均为单一峰，扩增曲线拐点清楚，指数期明显，排除了非特异性扩增和引物二聚体，扩增产物较好(图2～5)。

1.marker；2、3.β-actin；4、5.Foxp3。

图2 基因Foxp3扩增曲线

图3 基因Foxp3溶解曲线

图4 基因 β-actin 扩增曲线

图5 基因β-actin溶解曲线

2.2Foxp3 mRNA的表达水平比较 病例组患儿外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平(1.12±0.56)明显低于对照组(5.16±3.59)，差异有统计学意义(t=-7.63，P<0.001)。

3 讨 论

腺病毒是一群分布十分广泛的DNA病毒，主要在细胞核内繁殖，耐温、耐酸、耐脂溶剂的能力较强，除咽、结合膜及淋巴组织外，还在肠道繁殖，具有高滴度、高免疫原性等特点，常在扁桃体等淋巴组织中潜伏。腺病毒肺炎的主要病理改变为局灶性或融合性坏死性浸润和(细)支气管炎，临床上大约有近1/3 的腺病毒肺炎因各种原因转变为重症腺病毒肺炎[9]，导致多器官功能衰竭。在一些病毒感染中，免疫失调对疾病进展起着关键作用，局部过度的免疫反应会引起组织损伤与器官衰竭，而不充分的免疫反应则不利于病毒清除[10]。已有研究证实，CD4+T淋巴细胞能识别腺病毒衣壳蛋白[11]，具有免疫应答正性调节功能，其中辅助性T淋巴细胞(Th1)主要分泌干扰素(IFN)-γ、IFN-α、白细胞介素(IL)-2等炎性细胞因子增强抗感染能力，Th2主要分泌IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子辅助B淋巴细胞活化参与机体体液免疫。两者之间相互抑制增殖，由此说明Th1与Th2比例的失衡可能参与了病毒感染的发生[12]，随着分子免疫学研究的逐步深入，发现Th1/Th2平衡失调并不能完全阐明腺病毒肺炎的发病机制。

CD4+CD25+Treg一类具有免疫抑制功能的细胞亚群，主要分泌IL-4、IL-10和转化生长因子-β(TGF-β)等抑制自身炎性反应的细胞因子，防止引起组织破坏的病理性免疫应答发生，同时也是病原体长期存在难以清除的因素，延长了慢性感染的病程。Foxp3是CD4+CD25+Treg发育及启动抑制功能的关键基因，调控着Treg在胸腺的发育、外周的表达及功能的维持，是CD4+CD25+Treg特征性标记，其表达水平的高低能反映CD4+CD25+Treg的活性。有研究证实，成熟小鼠或人类缺失Foxp3、CD4+CD25+Treg将失去其抑制能力，同时增强组织炎性反应，从而提示Foxp3持续表达对CD4+CD25+Treg的稳定起着重要作用[13]。目前，关于转录调节因子Foxp3与儿童腺病毒肺炎发病关系的文献报道较少，本研究通过检查腺病毒肺炎患儿外周血中CD4+CD25+Treg的Foxp3表达水平，探讨了Foxp3在儿童腺病毒肺炎发病机制中的作用，结果显示，病例组患儿外周血中转录因子Foxp3表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，提示儿童腺病毒肺炎CD4+CD25+Treg水平降低和活性减弱，对机体的免疫反应丧失负性调节作用，导致腺病毒肺炎的发生、发展，但Foxp3在儿童腺病毒肺炎发病过程中更深层的作用及影响其转录因子表达的因素尚有待于进一步研究。