Xpert MTB/RIF与微量MIC快速检测利福平异质性耐药的分析

黄飞 陈俊林 瞿梅 顾德林 徐费凡 马娟

控制耐多药结核病是各国政府重点关注的卫生工作，近几年WHO更是将单耐利福平(RFP)肺结核纳入耐多药结核病范畴[1]。如肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)对RFP耐药，则同时对异烟肼耐药可能性明显增加[2]，导致疗效明显降低、预后不良。如果能早期快速精准诊断耐RFP肺结核并即时调整治疗方案，可避免无效用药，同时在一定程度上避免低频率、低耐药MTB逐步演变成高频率、耐多药MTB，因此寻找到能快速精准检测RFP耐药MTB的药敏技术非常重要。目前诊断RFP耐药的金标准仍然为罗氏培养(L-J)及比例法药敏技术、但需耗时2个月左右，不能满足临床需要； BACTEC MGIT960是能和比例法药敏结果相媲美的自动化快速表型药敏检测技术[3-4]，但设备及试剂价格昂贵，无法推广应用。随着科技进步，一些新的能快速检测RFP耐药MTB的技术已在临床得到应用，如筛查RFP耐药的分子药敏技术XpertMTB/RIF，虽然检测结果和表型药敏技术之间存在一定差异[5]，但检测快速、仅需要几小时就能自动筛查出标本中微量的MTB以及其rpoB基因是否发生突变[6-7]；微量MIC技术是近年来发展较为迅速的微量液体表型药敏技术，目前应用效果和比例法药敏技术相比仍然有一些不足[8-9]，但检测速度快、成本低，应用前景非常好。为评估XpertMTB/RIF和微量MIC在快速精准检测RFP耐药MTB的临床价值，本课题组将肺结核患者的涂阳痰标本作为检测对象，以比例法药敏作为对照标准，分别观察Xpert MTB/RIF与微量MIC检测效能，对产生异质性耐药的可能原因进行分析，结果如下。

资料与方法

一、一般资料

1 标本来源

MTB标准株(H37Rv ATCC27294)购自国家菌种保藏中心，收集2016年8月～2020年2月在南通市第六人民医院就诊的466例肺结核患者的涂阳痰标本，其中男256例，女210例，年龄18～83岁，平均50岁。对每例肺结核患者均详细记录用药史。痰抗酸杆菌菌量分级：按照《结核病诊断实验室检验规程》[10]，以1+、2+、3+、4+记录，其中94例标本1+、110例标本2+、136例标本3+、126例标本4+。

2 主要试剂和仪器

iddlebrook 7H9培养基干粉、OADC营养添加剂购自美国BD(Becton Dickinson)公司；RFP购自美国Fluka公司；GNP-92700隔水式培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；GeneXpert仪器及Xpert MTB/RIF检测试剂盒购自美国Cepheid公司；对硝基苯甲酸(PNB)购自美国Sigma公司；24孔变色硅胶微孔板，由上海积彩医疗器械有限公司提供；微孔板检测仪购自东乐自然基因生命科学公司；罗氏培养基及及7H9培养基由本实验室自配。

二、方法

1 标本处理

取干酪样或脓样晨痰1mL于试管内，加入4mL 4%NaOH并进行振荡使痰液充分消化，移入37 ℃水浴箱，15min后用1mmol/L的磷酸盐缓冲液中和，以3000r/min转速(1750g离心力)离心30min后移入37 ℃水浴电热恒箱内。

2 L-J培养、菌型鉴定及比例法药敏试验

按照《结核病诊断实验室检验规程》[10]中的标准化操作程序进行操作。质量控制：每次药敏试验均采用H37Rv标准株作为阳性参照。

3 XpertMTB/RIF核酸扩增检测

按检测说明书操作，系统自动进行检测和结果判断，2h内判断标本内是否存在MTB以及是否存在rpoB基因突变。结果报告为：MTB检出或未检出，检出菌量为高、中、低、极低；MTB检出报告同步显示rpoB基因突变的结果：△CT≥3.5，有基因突变；△Ct<3.5，无基因突变(Ct是指探针循环域值，△Ct指探针早期Ct值与晚期Ct值之差)，基因检测探针分别以probe A、probeB、probeC、probeD、probeE命名。

4 微量MIC检测涂阳标本中MTB对RFP药物敏感性

微量MIC检测工具，采用的是24孔变色硅胶微孔板作为MTB培养载体，参考文献方法[11]，RFP药敏的耐药界值设定为1μg/mL。用二甲基甲酰胺溶解配制成10mg/mL，再用7H9培养基分别稀释成所需浓度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/mL)；PNB用液体培养基稀释，终浓度为800μg/mL。24孔微孔板中设定阳性对照孔、阴性对照孔、测试孔、PNB含药孔。阳性对照孔加不含药培养基0.4mL、接种0.4mL标本沉淀悬浊液；测试孔中分别加入不同终浓度0.4mL含RFP培养基，再接种0.4mL标本沉淀悬浊液；阴性对照孔加不含药培养基0.8mL、不接种菌，作为阴性控制；PNB含药孔加PNB稀释液0.4mL及标本沉淀悬浊液0.4mL，用透明胶带将培养板封好装入密封袋，置于37 ℃温箱培养。从培养第2天起，每天观察微孔板底硅胶颜色是否由天蓝色逐渐变黄色。若观察期间内对照孔底硅胶颜色改变，PNB含药孔底硅胶颜色改变，则说明标本中生长的细菌为非结核分枝杆菌；当测试孔底先于对照孔或与对照孔同时发生硅胶颜色改变，说明药物不能抑制测试孔内MTB繁殖，判断该测试孔内MTB对RFP耐药；当阳性对照孔底硅胶颜色改变，测试孔尚未改变，说明测试孔MTB生长被药物抑制，判为敏感。结果判断时间为21天，超过21天不生长需重复试验。质量控制：每次实验均以H37Rv为敏感株质控，以牛分枝杆菌为耐药株质控。

5 XpertMTB/RIF、微量MIC与比例法药敏结果不一致的MTB临床分离菌株进行基因扩增和rpoB基因测序，PCR产物纯化和测序工作委托上海生工生物工程有限公司完成，PCR引物检测序列涵盖rpoB基因的第507至533位密码子的核心区域，其引物碱基设计序列为5′-GGTCGCCGCGATCAAGGAGTT-3′，5′-TCTGATCGGCTCGCTGTCGGT-3′，扩增片段234bp。

三、统计学方法

结 果

一、三种药敏方法检测466例痰标本结果

L-J培养及比例法药敏结果：培养报告为阴性34例、阳性432例，35例鉴定为非结核分枝杆菌、397例鉴定为MTB，其中77例痰标本中MTB对RFP耐药。微量MIC检测结果：培养报告阴性34例，阳性432例，35例鉴定为非结核分枝杆菌，397例鉴定为MTB，其中76例痰标本中MTB对RFP耐药。Xpert MTB/RIF检测结果：检测到MTB 431例，其中94例MTB检出rpoB基因发生突变。三种药敏方法检出的阳性例数、MTB检出例数、耐药检出例数(%)(见表1)。

表1 三种药敏方法检出的阳性例数、MTB检出例数、耐药检出例数[n(%)]

二、微量MIC药敏结果分布情况

397例标本中MTB在RFP不同终浓度下药敏结果：120株0.125μg/mL；129株0.25μg/mL；72株0.5μg/mL；10株1.0μg/mL；37株2.0μg/mL；18株4.0μg/mL；8株8.0μg/mL；3株16.0μg/mL(见表2)。

表2 397例标本中MTB在RFP不同终浓度下MIC分布情况(%)

三、Xpert MTB/RIF耐药探针

检测到基因突变标本94例，分别为probeA 8例、 probeB 5例、 probeC 8例、probeA+probeC 2例、probeD 33例、probE 37例、probeE +C 1例。probeA及probB检测结果共13例，占13.8%。rpoB基因突变探针报告结果与菌量报告结果见表3。

四、L-J培养及比例法药敏、微量MIC及Xpert MTB/RIF检测结果比较

L-J培养及微量MIC两种方法菌型鉴定结果完全一致，两种药敏方法同时检出耐RFP的MTB 76株，以比例法药敏为对照标准，微量MIC符合率为99.7%(396/397)，敏感性为100%(76/76)，特异性为99.7%(320/321)，两种方法结果基本一致(Kappa=0.99)，差异无统计学意义(χ2=0.25,P>0.05)；L-J培养及比例法药敏与Xpert MTB/RIF比较：12株Xpert MTB/RIF检出rpoB基因突变而L-J培养阴性，12株Xpert MTB/RIF检出rpoB基因突变而比例法药敏报告为敏感，7株Xpert MTB/RIF检测rpoB基因未发生突变而比例法药敏报告为耐药。以比例法药敏为对照标准，Xpert MTB/RIF符合率为95.2(378/197)，敏感性为85.4%(70/82)，特异性为97.8%(76/76)，两种方法结果一致性好(Kappa=0.85),差异无统计学意义(χ2=1.17、P>0.05)。三种方法检测结果一致性与异质性比较见表4。比例法药敏和微量MIC药敏报告平均时间分别为52.5天和17.5天，差异有统计学意义(t=4.64，t>t(df)0.001、P<0.05)(见表5)。

表4 三种方法检测结果一致性及异质性比较(以L-J培养及比例法药敏为诊断标准)(n=397)

表5 比例法药敏和微量MIC药敏报告时间比较(单位：天)(n=397)

五、XpertMTB/RIF检出rpoB基因突变与比例法药敏异质性结果及既往用药史情况(见表6)。

表6 XpertMTB/RIF检出rpoB基因突变与比例法药敏异质性结果

六、对L-J培养阳性，XpertMTB/RIF检出rpoB基因突变、微量MIC与比例法药敏结果不一致的MTB分离菌株进行测序。1株微量MIC与比例法药敏结果不一致的MTB临床分离菌株rpoB基因未发生突变；7株XpertMTB/RIF检测rpoB基因未发生突变而比例法药敏报告为耐药的菌株，rpoB基因测序未见基因突变；12株XpertMTB/RIF检出rpoB基因突变而比例法药敏报告为敏感的菌株，rpoB基因测序可见基因突变，突变氨基酸位置：511位点突变7株：密码子改变CTG→CCG、氨基酸改变Ser→Leu；516位点突变5株：密码子改变GAC→GTC、氨基酸改变Asp→Gly(见表7)。

表7 XpertMTB/RIF检出rpoB基因突变而比例法敏感的MTB临床分离株基因测序结果

讨 论

如能快速精准检测到肺结核患者痰标本中RFP耐药MTB，可及时调整治疗方案，提高治愈率。L-J培养及比例法药敏技术作为诊断RFP耐药的金标准，虽然为各级结核病防治机构常规开展的检验方法、但因耗时过长不能满足临床需要。目前筛查RFP耐药最快速最灵敏的药敏技术首推Xpert MTB/RIF，该技术采用半巢式PCR，针对MTB的rpoB基因81bp耐药决定区设计了5个分子信标探针，将MTB的DNA提取、PCR扩增和荧光检测结合在一起，能快速检测标本中微量MTB,并同时判断rpoB基因是否发生突变，是目前检测RFP耐药MTB的最佳分子药敏技术[13-15]。以比例法药敏试验结果为判断标准，对本课题组400余例涂阳痰标本最终检测结果分析，Xpert MTB/RIF检测结果同比例法药敏相比一致性较好(Kappa=0.85)，提示利用Xpert MTB/RIF快速检测RFP耐药MTB可靠性高、值得推广应用。虽然两种方法的检测结果大多数一致，但小部分差异性结果，即异质性耐药[16]，可能会影响临床医生的判断并导致误诊误治，给患者带来不必要的身心损害。因此在积极利用Xpert MTB/RIF筛查RFP耐药MTB同时，必须对出现异质性耐药的原因进行认真分析。通过对本课题组中所有异质性耐药MTB的rpoB基因测序的结果及患者的病史进行分析，笔者认为原因可能有以下几方面：(一)部分肺结核患者在痰标本送检前可能已接受了多种一线和二线抗结核药物的治疗，导致痰标本中MTB存在多种状态：如活菌、死菌(DNA未降解)、L型MTB等[17]。而Xpert MTB/RIF是基于MTB的DNA提取、PCR扩增为基础的基因检测技术，对DNA未降解的各种状态的MTB都能进行有效检测，这就容易导致Xpert MTB/RIF检测和L-J培养及比例法药敏结果不一致，如本实验组中利用XpertMTB/RIF检测到12株菌株rpoB基因发生突变而L-J培养阴性菌株，结合其用药史、考虑标本中MTB为死菌；(二)标本中敏感MTB为优势菌群、同时存在低频率RFP耐药MTB，这时如果对标本处理不当[18]，可导致耐药菌DNA不能被有效提取及PCR扩增。本组利用Xpert MTB/RIF检测到1株rpoB基因无突变、但L-J培养阳性，且比例法药敏提示RFP耐药MTB，在培养基上仅见3个菌落生长，提示低频率异质性耐药菌容易被漏检；(三)因抗结核药物诱导刺激使MTB外排泵基因过表达或者发生突变、如类泛素蛋白-蛋白酶体系统中相关的Pup、Dop、PafA、Mpa等相关外排泵基因在RFP耐药中作用已越来越得到重视[19]，可能出现比例法药敏结果提示RFP耐药但rpoB基因未发生突变[20-21]，本实验中比例法药敏结果提示6株RFP耐药MTB但rpoB基因未发生突变，可能是MTB外排泵基因作用导致耐药。(四)rpoB基因片段不同位点基因突变或者同一个位点不同氨基酸密码子突变、可能导致耐药程度不一致，即所谓低水平耐药或者高水平耐药[22]。Xpert MTB/RIF分子信标探针如probeA、probeB检测区域相对应包含511、516位点基因，可能是低水平耐药突变位点区域[23]，这一片段基因突变时，利用Xpert MTB/RIF和比例法药敏试验检测可能会出现不一致结果，对本组中12株两种药敏结果不一致的MTB分离菌株、通过基因测序证明rpoB基因片段不同位点基因发生突变导致耐药水平有明显差异。XpertMTB/RIF虽然是筛查RFP耐药的最快速最敏感检测技术，但结果的精准性仍然值得进一步研究[24]。

确诊RFP耐药MTB及耐药程度的高低，仍然要依赖表型药敏检测技术，而找到可替代比例法药敏或者BACTEC MGIT960的快速表型药敏检测技术已成为研究热点，本课题组关注的液体药敏检测技术，如微量MIC检测快速、还可以观察到MTB在各药物终浓度下药敏结果分布情况，能帮助临床医师快速精准选择抗结核药物，是最具有应用前景表型药敏技术。目前临床常用的微量MIC检测工具是以普通的微孔板作为培养载体的，依靠肉眼观察微孔板内是否出现白色菌体沉淀或形成特殊索状结构来判断药敏结果，但易受结核菌菌量及毒力等因素影响结果判断，所以实际应用效果和L-J培养及比例法药敏仍然有一定差距[25]。本课题组选择了最新研制的微量液体培养技术结合变色硅胶观察技术(即可视化的微量MIC)作为普通微量MIC的升级版[26-27]，在实际应用中与L-J培养及比例法药敏进行对照，结果显示可视化的微量MIC法药敏符合率、敏感性、及特异性大于99%，两种检测方法结果一致性非常好，可靠性优于普通微量MIC。可视化微量MIC药敏平均报告时间为17.5天，与BACTEC MGIT960药敏报告时间相似[11]，优于比例法药敏平均报告时间52.5天。经过观察技术改进，微量MIC完全可以成为检测快速、成本低廉、高灵敏、高特异的表型药敏技术，在临床推广应用。在L-J培养及比例法药敏报告明显滞后的情况下，如果能保证质控效果，可将微量MIC药敏结果作为判断标准。本组中出现1株微量MIC提示，对RFP敏感而比例法药敏结果提示耐药MTB，经过基因测序证明rpoB基因未发生突变，原因可能为标本中存在低频率、以外排泵基因突变或者过表达为主的MTB耐药菌，在微量MIC常规药敏结果判断期限内，因繁殖缓慢导致菌量过少不易被检测到。

笔者认为在坚持L-J培养及比例法药敏金标准前提下，既要充分利用好Xpert MTB/RIF和微量MIC的优秀检测性能，也要关注并认真分析出现的小概率异质性耐药事件。例如对既往用药史长，效果不佳的绝大部分复治涂阳肺结核患者，如果痰标本中检出probeC、probeD、probeE片段基因发生突变的MTB，即可判断RFP高水平耐药、需要及时调整治疗方案，但对部分正在接受二线方案治疗的患者，需要判断送检标本中MTB是否为死菌。对初治肺结核患者、如果痰标本中检出probeA、probeB片段基因发生突变的MTB，可能为rpoB基因片段的低水平耐药区域某位点发生基因突变，这时调整治疗方案就需要谨慎，而同时进行微量MIC可快速有效检测到不同RPF浓度下MTB的MIC[28]，弥补Xpert MTB/RIF检测结果的不足，为制定合理方案提供依据[27]。