灵芝乙醇提取物上调Syk抑制胰腺癌细胞SW1990增殖、迁移和侵袭的研究

王海 徐幸幸 马海 彭勇

胰腺癌是人类最恶性的实体瘤之一，其特征在于诊断晚，进展快，早期转移和化学耐药性。尽管近年来使用了越来越多的疗法，包括手术切除，化学疗法和放射疗法，但患者总体5年生存率仍<5%[1,2]。因此，迫切需要开发新的诊断和治疗策略，并阐明相关的分子机制，以提高胰腺癌的诊断准确性和临床治疗。灵芝系多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，具有补气安神，止咳平喘的功效，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食[3]。研究发现，灵芝乙醇提取物具有抑制胰腺癌、肺癌、宫颈癌等肝癌、胃癌、乳腺癌细胞增殖的作用，表现出一定的抗肿瘤效果[4]。临床资料表明，灵芝提取物对胰腺癌[5]的治疗效果满意，可以延长生存期，提高患者生活质量。但是，灵芝乙醇提取物对胰腺癌细胞迁移和侵袭的功能与分子机制仍不清楚，生物标志物在肿瘤治疗中的应用尚需进一步验证。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)此前被证明在胰腺癌中低表达，能够抑制胰腺癌的生长和转移[6,7]。但是Syk是否参与灵芝乙醇提取物影响胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭过程尚未可知。基于此，本研究考察不同浓度的灵芝乙醇提取物对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并通过Syk基因探索其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 灵芝乙醇提取物(黄色粉末，含量为63.77 g/g生药，成都荣保生物科技开发有限公司)，胰腺癌细胞SW1990(美国典藏培养物保存中心)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司)，Syk过表达质粒pcDNA3.1-Syk、过表达空载质粒pcDNA3.1(上海GenePharma公司)，细胞核相关抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)小鼠单克隆抗体、上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)小鼠单克隆抗体、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)小鼠单克隆抗体及Syk小鼠单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(英国Abcam公司)。

1.2 细胞培养 细胞SW1990在RPMI 1640培养基中(10%胎牛血清、100 mg/ml链霉素和100 U/ml青霉素)培养，并在37℃、5% CO2的培养箱内生长。

1.3 细胞分组与处理 将对数生长期的细胞SW1990分为以下几组：对照组(未给予药物)，低剂量药物组(给予25 μg/ml灵芝乙醇提取物)，中剂量药物组(给予50 μg/ml灵芝乙醇提取物)，高剂量药物组(给予100 μg/ml灵芝乙醇提取物)，pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-Syk组(转染pcDNA3.1-Syk)，高剂量药物组+pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1并给予100 μg/ml灵芝乙醇提取物)，高剂量药物组+pcDNA3.1-Syk组(转染pcDNA3.1-Syk并给予100 μg/ml灵芝乙醇提取物)。其中，灵芝乙醇提取物作用时间为48 h。在进行细胞转染时，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂将pcDNA3.1-Syk、pcDNA3.1质粒转染到40%～50%汇合状态的SW1990细胞。转染24 h后，使用不同浓度的灵芝乙醇提取物处理。

1.4 MTT比色法检测细胞存活 收集不同处理的细胞SW1990，按1×105个/ml的密度接种于96孔板。培养48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔20 μl，37℃孵育4 h，加入二甲基亚砜150 μl，剧烈振荡10 min以溶解结晶。……